Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach den bhrobhsair a tha thu a’ cleachdadh.Airson na builean as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu dreach nas ùire den bhrobhsair agad (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).Anns an eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, tha sinn a 'sealltainn na làraich gun stoidhle no JavaScript.
Faodaidh lorg agus cleachdadh buannachdail de thoraidhean nàdarra cuideachadh le bhith ag adhartachadh beatha dhaoine.Bithear a’ cleachdadh cheimigean bacadh fàs planntrais gu farsaing mar luibhrigean gus smachd a chumail air luibhean.Air sgàth 's gu bheil feum air diofar sheòrsaichean luibh-bhiastagan a chleachdadh, tha feum air coimeasgaidhean a chomharrachadh le dòighean gnìomh ùra.Anns an sgrùdadh seo, lorg sinn todhar N -alkoxypyrrole nobhail, coumamonamide, bho Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus stèidhich sinn am pròiseas synthesis iomlan.Tro mheasaidhean gnìomhachd bith-eòlasach, lorg sinn gu bheil searbhag urs-monoamic na eadar-mheadhan synthetigeach de urs-monoamide agus comasbacadh fàs lusan.A bharrachd air an sin, tha sinn air grunn derivatives searbhag urbenonic a leasachadh, a’ toirt a-steach an derivative urbenyloxy (UDA), aig a bheil gnìomhachd luibheach àrd gun a bhith a’ toirt droch bhuaidh air fàs cheallan HeLa.Lorg sinn cuideachd gu bheil derivatives aigéad urmotonic a’ cur dragh air microtubules planntrais;A bharrachd air an sin, tha KAND a’ toirt buaidh air filamentan actin agus a’ toirt bàs cealla;Tha na buaidhean ioma-thaobhach seo eadar-dhealaichte bhon fheadhainn aig luchd-dìon microtubule aithnichte agus tha iad a’ moladh dòigh-obrach ùr airson searbhag ursonic, a tha a’ riochdachadh buannachd chudromach ann an leasachadh luibhrigean ùra.
Tha lorg agus cleachdadh practaigeach de thoraidhean nàdarra buannachdail agus na toraidhean aca mar dhòigh air càileachd beatha dhaoine a leasachadh.Tha metabolites àrd-sgoile air an dèanamh le meanbh-fhàs-bheairtean, planntrais agus biastagan air leantainn gu adhartasan mòra ann an cungaidh-leigheis agus àiteachas.Chaidh mòran antibiotics agus drogaichean an-aghaidh leucemia a leasachadh bho thoraidhean nàdarra.A bharrachd air an sin, tha diofar sheòrsaichean de stuthan annpuinnsean-bhiastagan, tha fungicides agus luibhrigean air an toirt a-mach às na toraidhean nàdarra sin airson an cleachdadh ann an àiteachas.Gu sònraichte, tha luibhrigean smachd luibhean nan innealan cudromach airson toradh bàrr àrdachadh ann an àiteachas an latha an-diugh, agus tha diofar sheòrsan todhar air an cleachdadh gu malairteach mu thràth.Thathas den bheachd gu bheil grunn phròiseasan ceallach ann am planntrais, leithid photoynthesis, metabolism amino-aigéid, synthesis balla cealla, riaghladh mitosis, comharran phytohormone, no synthesis pròtain, mar thargaidean àbhaisteach de luibhrigean.Tha todhar a tha a’ cur bacadh air gnìomhachd microtubule nan seòrsa cumanta de luibhrigean a bheir buaidh air fàs planntrais le bhith a’ toirt buaidh air riaghladh mitotic2.
Tha microtubules nam pàirtean den cytoskeleton agus tha iad air an gleidheadh gu farsaing ann an ceallan eukaryotic.Tha an heterodimer tubulin air a dhèanamh suas de α-tubulin agus β-tubulin a’ cruthachadh protofilaments sreathach microtubule, le protofilaments 13 a ’cruthachadh structar siolandair.Bidh grunn dhleastanasan aig microtubules ann an ceallan planntrais, a’ gabhail a-steach a bhith a’ dearbhadh cumadh cealla, roinneadh cealla, agus còmhdhail intracellular3,4.Ann an ceallan planntrais tha microtubules fon membran plasma interphase, agus thathas den bheachd gu bheil na microtubules cortical sin ris an canar smachd air eagrachadh microfibrils ceallalose tro riaghladh iom-fhilltean ceallalose synthase4,5.Tha microtubules cortical de cheallan epidermal freumh, a tha an làthair anns an raon de leudachadh luath air a’ mhullach freumha, suidhichte air an taobh thall, agus bidh microfibers ceallalose a’ leantainn nam microtubules sin agus a’ cuingealachadh slighe leudachadh cealla, agus mar sin a’ brosnachadh leudachadh cealla anisotropic.Mar sin, tha dlùth cheangal eadar gnìomh microtubule ri morf-eòlas planntrais.Bidh ionadan amino-aigéid ann an ginean a’ còdachadh tubulin ag adhbhrachadh smeòrach de arrays microtubule cortical agus fàs taobh clì no deas ann an Arabidopsis 6,7.Mar an ceudna, faodaidh mùthaidhean ann am pròtanan co-cheangailte ri microtubule a bhios a’ riaghladh daineamaigs microtubule cuideachd leantainn gu fàs freumhaich air a shaobhadh8,9,10,11,12,13.A bharrachd air an sin, tha làimhseachadh le luibh-bhiastagan a tha a’ buaireadh microtubule leithid disopyramide, ris an canar cuideachd pretilachlor, cuideachd ag adhbhrachadh fàs freumh oblique air an taobh chlì14.Tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil riaghladh mionaideach air gnìomh microtubule deatamach airson a bhith a’ dearbhadh slighe fàs planntrais.
Chaidh diofar sheòrsaichean de luchd-bacadh microtubule a lorg, agus tha na drogaichean sin air cur gu mòr ri rannsachadh cytoskeletal, a bharrachd air àiteachas agus leigheas2.Gu sònraichte, faodaidh oryzalin, todhar dinitroaniline, disopyramide, todhar co-cheangailte ri benzamide, agus an analogs bacadh a chuir air gnìomhachd microtubule agus mar sin casg a chuir air fàs planntrais.Mar sin, tha iad air an cleachdadh gu farsaing mar luibh-bhiastagan.Ach, leis gu bheil microtubules nam pàirt chudromach de cheallan planntrais is bheathaichean, tha a’ mhòr-chuid de luchd-bacadh microtubule cytotoxic don dà sheòrsa cealla.Mar sin, a dh’ aindeoin an cleachdadh aithnichte mar luibhrigean, thathas a’ cleachdadh àireamh chuingealaichte de riochdairean antimicrotubule airson adhbharan practaigeach.
Tha Streptomyces na sheòrsa den teaghlach Streptomyces, a tha a’ toirt a-steach bacteria aerobic, gram-positive, filamentous agus tha e ainmeil fad is farsaing airson a chomas raon farsaing de mheatabolites àrd-sgoile a thoirt gu buil.Mar sin, thathas den bheachd gur e seo aon de na stòran as cudromaiche de thoraidhean nàdarra ùra a tha gnìomhach gu bith-eòlasach.Anns an sgrùdadh làithreach, lorg sinn todhar ùr ris an canar coumamonamide, a chaidh a sgaradh bho Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus S. werraensis ISP 5486. A’ cleachdadh mion-sgrùdadh speactram agus mion-sgrùdadh làn speactram, bha structar coumamonamide air a chomharrachadh agus a chnàmhan sònraichte N-alkoxypyrrole. chaidh a dhearbhadh.sintéise.Chaidh a lorg gu robh searbhag Ursmonic, eadar-mheadhanach synthetigeach de ursmonoamide agus na toraidhean aige, a’ cur bacadh air fàs agus germachadh a’ phlannt modail mòr-chòrdte Arabidopsis thaliana.Ann an sgrùdadh dàimh structar-gnìomh, lorg sinn gu bheil todhar le C9 air atharrachadh gu searbhag ursonic, ris an canar nonyloxy derivative de ursonic acid (KAND), gu mòr a’ cur ris a’ bhuaidh bacaidh air fàs agus germachadh.Gu sònraichte, thug an neach-dìon fàs planntrais a chaidh a lorg às ùr buaidh cuideachd air fàs tombaca agus cuislean aibheach agus cha robh e cytotoxic dha bacteria no ceallan HeLa.A bharrachd air an sin, bidh cuid de thoraidhean searbhag urmotonic a’ toirt a-steach feallsanachd freumhach claon, a’ ciallachadh gu bheil na toraidhean sin a’ toirt buaidh dhìreach no neo-dhìreach air microtubules.Co-chòrdail ris a’ bheachd seo, tha ar beachdan air microtubules air an ainmeachadh an dàrna cuid gu immunohistochemically no le pròtanan flùraiseach a’ nochdadh gu bheil làimhseachadh KAND a’ dèanamh dì-phoilerachadh air microtubules.A bharrachd air an sin, chuir làimhseachadh le derivatives searbhag kumamotonic dragh air microfilaments actin.Mar sin, tha sinn air inneal-dìon fàs planntrais ùr a lorg aig a bheil dòigh gnìomh sònraichte a’ toirt a-steach sgrios an cytoskeleton.
Strain MK493-CF1 air a sgaradh bhon ùir ann an Shinagawa-ku, Tokyo.Chruthaich strain MK493-CF1 mycelium stromal le deagh mheur.Chaidh sreath pàirt den ghine RNA ribosomal 16S (1422 bp) a dhearbhadh.Tha an strain seo glè choltach ri S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain àbhaisteach, 99.93%).Stèidhichte air a’ bhuil seo, chaidh a dhearbhadh gun robh dlùth cheangal eadar an strain seo agus an seòrsa strain S. werraensis.Mar sin, thug sinn an t-ainm seo gu sealach S. werraensis MK493-CF1.Bidh S. werraensis ISP 5486T cuideachd a’ toirt a-mach na h-aon choimeasgaidhean bith-ghnìomhach.Leis nach robh mòran rannsachaidh tràth air a bhith a 'faighinn stuthan nàdarra bhon mhion-fhàs-bheairt seo, chaidh tuilleadh rannsachaidh ceimigeach a dhèanamh.Às deidh àiteachadh S. werraensis MK493-CF1 air meadhan eòrna le coipeadh stàite cruaidh aig 30 ° C airson 14 latha, chaidh am meadhan a thoirt a-mach le 50% EtOH.Chaidh 60 ml de shampall a thiormachadh gus 59.5 mg de thoraidhean amh fhaighinn.Chaidh an earrann amh a thoirt gu ìre cùil HPLC gus N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ainmichte coumamonamide, 36.0 mg) a thoirt seachad.Tha an àireamh iomlan de 1 timcheall air 60% den toradh amh.Mar sin, chuir sinn romhainn sgrùdadh mionaideach a dhèanamh air feartan kumamotoamide 1.
Is e pùdar geal amorphous a th’ ann an Coumamonamide 1 agus tha speactrometry tomad àrd-rèiteachaidh (HRESIMS) a’ dearbhadh C6H8N2O2 (Fig. 1).Tha a’ chriomag pyrrole a chaidh a chuir an àite C2 den todhar seo air a chomharrachadh le δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ann an speactram 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) agus δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), agus tha an speactram 13C NMR a’ sealltainn làthaireachd ceithir atoman gualain sp2.Chaidh làthaireachd buidheann amide aig suidheachadh C2 a mheasadh le co-dhàimh HMBC bhon phroton C-3 gu carbon amide carbonyl aig δC 161.1.A bharrachd air an sin, tha stùcan 1 H agus 13 C NMR aig δH 4.10 (3H, S) agus δC 68.3 a’ comharrachadh gu bheil buidhnean N-methoxy anns a’ mholacile.Ged nach deach suidheachadh ceart na buidhne methoxy a dhearbhadh fhathast le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh speactroscopach leithid speactroscopaidh eadar-dhealachaidh leasaichte agus giorrachadh Overhauser niùclasach (NOEDF), thàinig N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide gu bhith mar a’ chiad tagraiche tagraiche.
Gus structar ceart 1 a dhearbhadh, chaidh synthesis iomlan a dhèanamh (Fig. 2a).Mar thoradh air làimhseachadh 2-aminopyridine 2 a bha ri fhaighinn gu malairteach le m-CPBA thàinig an N-oxide 3 co-fhreagarrach ann an toradh cainneachdail.Às deidh an 2-aminoazidation de 2, chaidh an ath-bhualadh cyclocondensation a mhìnich Abramovich a dhèanamh ann am benzene aig 90 ° C gus an 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 a bha thu ag iarraidh fhaighinn ann an graman.Astar 60% (dà ìre).15,16.Thug methylation agus hydrolysis de 4 an uairsin searbhag 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (ris an canar “searbhag cumotonic”, 6) ann an toradh math (70%, dà cheum).Mu dheireadh, thug lasachadh tro acid chloride intermediate 6 a’ cleachdadh ammonia uisgeach toradh Kumamoto amide 1 ann an 98%.Bha a h-uile dàta speactram de 1 synthesized coltach ri 1 iomallach, agus mar sin chaidh structar 1 a dhearbhadh;
Synthesis coitcheann agus mion-sgrùdadh air gnìomhachd bith-eòlasach urbenamide agus searbhag urbenic.(a) Synthesis iomlan de Kumamoto amide.(b) Chaidh sìol-chraobhan seachd-latha de sheòrsa fiadhaich Arabidopsis Columbia (Col) fhàs air truinnsearan Murashige agus Skoog (MS) anns an robh coumamonamide 6 no coumamonamide 1 aig na dùmhlachdan comharraichte.Bàr sgèile = 1 cm.
An toiseach, rinn sinn measadh air gnìomhachd bith-eòlasach urbenamide agus na h-eadar-mheadhanan aige airson an comas fàs planntrais atharrachadh.Chuir sinn diofar cho-chruinneachaidhean de ursmonamide 1 no searbhag ursmonic 6 ri sìol-chraobhan MS agar meadhanach agus cultarach Arabidopsis thaliana air a’ mheadhan seo.Sheall na measaidhean sin gun do chuir co-chruinneachaidhean àrda (500 μM) de 6 bacadh air fàs freumhan (Fig. 2b).An uairsin, chruthaich sinn grunn thoraidhean le bhith a’ cur an àite suidheachadh N1 de 6 agus rinn sinn sgrùdaidhean dàimh structar-gnìomh orra (tha am pròiseas synthesis analog air a mhìneachadh anns an Fiosrachadh Taic (SI)).Chaidh sìolaidhean Arabidopsis fhàs air meadhan anns an robh 50 μM de thoraidhean searbhag ursonic, agus chaidh fad freumh a thomhas.mar a chithear san dealbh.Mar a chithear ann am Figearan 3a, b, agus S1, tha diofar fhaid de shlabhraidhean alkoxy sreathach aig searbhagan coumamo (9, 10, 11, 12, agus 13) no slabhraidhean mòra alkoxy (15, 16, agus 17) aig suidheachadh N1.Sheall na derivatives bacadh mòr air fàs freumhan.A bharrachd air an sin, lorg sinn gun do chuir cleachdadh 200 μM 10, 11, no 17 bacadh air ginideachadh (Figs. 3c agus S2).
Sgrùdadh air an dàimh structar-gnìomh eadar Kumamoto amide agus todhar co-cheangailte.(a) Structar agus sgeama synthesis analogues.(b) Tomhas air fad freumh sìolaidhean 7-latha a dh'aois air fhàs air meadhan MS le no às aonais derivatives coumamonamide 50 μM.Tha rionnagan a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh sham (t test, t<0.05).n>18. Tha dàta air a shealltainn mar mheadhan ± SD.nt a’ ciallachadh “gun deuchainn” leis nach do dh’ fhàs còrr air 50% de na sìol.(c) A’ tomhas ìre ginideachadh sìol làimhseachaidh air a ghintinn airson 7 latha ann am meadhan MS le no às aonais 200 μM coumamonamide agus todhar co-cheangailte ris.Tha rionnagan a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh sham (deuchainn chi-ceàrnagach).n=96.
Gu h-inntinneach, lùghdaich slabhraidhean taobh alcyl nas fhaide na C9 an gnìomhachd bacaidh, a’ moladh gu bheil feum aig todhar co-cheangailte ri searbhag kumamotoic air slabhraidhean taobh de mheud sònraichte gus an gnìomhachd bith-eòlasach aca a thaisbeanadh.
Leis gun do sheall mion-sgrùdadh dàimh structar-gnìomh gun deach C9 atharrachadh gu searbhag ursonic agus gur e toradh nonyloxy de dh’ aigéad ursonic (air an canar KAND 11 an-seo) an neach-dìon fàs planntrais as èifeachdaiche, rinn sinn comharrachadh nas mionaidiche air KAND 11. Làimhseachadh Arabidopsis le 50 μM KAND 11 cha mhòr gu tur a 'cur bacadh air ginideachadh, ach chuir co-chruinneachaidhean nas ìsle (40, 30, 20, no 10 μM) de KAND 11 bacadh air fàs freumhan ann an dòigh a bha an urra ri dòs (Fig. 4a, b).Gus deuchainn a dhèanamh a bheil KAND 11 a’ toirt buaidh air comasachd freumh meristem, rinn sinn sgrùdadh air meristems freumha air an dath le propidium iodide (PI) agus meud sgìre meristem air a thomhas.B’ e meud meristem sìolaidhean a chaidh fhàs air meadhan anns an robh 25 μM KAND-11 151.1 ± 32.5 μm, agus b’ e meud meristem sìolaidhean a chaidh fhàs air meadhan smachd anns an robh DMSO 264.7 ± 30.8 μm (Fig. ). , a tha a’ nochdadh gu bheil KAND-11 ag ath-nuadhachadh gnìomhachd cealla.sgaoileadh.Root meristem.Co-chòrdail ri seo, lughdaich làimhseachadh KAND 11 an àireamh de chomharran roinn cealla CDKB2; 1p :: CDKB2; comharra 1-GUS anns a’ bhunait meristem (Fig. 4e) 17 .Tha na toraidhean sin a’ nochdadh gu bheil KAND 11 a’ cur bacadh air fàs freumhan le bhith a’ lughdachadh gnìomhachd iomadachaidh cealla.
Mion-sgrùdadh air a’ bhuaidh bacaidh a th’ aig derivatives urbenonic acid (torbenyloxy derivatives) air fàs.(a) Sìol-shìolaidhean seòrsa fiadhaich 7-latha a dh'aois air fhàs air truinnsearan MS leis na h-àireamhan comharraichte de KAND 11. Bàr sgèile = 1 cm.(b) Tomhas fad freumha.Tha litrichean a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra (deuchainn Tukey HSD, td<0.05).n>16. Tha dàta air a shealltainn mar mheadhan ± SD.(c) Miocroscopan confocal de fhrith-fhrith-rathaidean dathte propidium iodide Col air fàs air truinnsearan MS le no às aonais 25 μM KAND 11. Tha camagan geal a’ comharrachadh bun-meristem.Bàr sgèile = 100 µm.(d) Tomhas air meud freumh meristem (n = 10 gu 11).Chaidh eadar-dhealachaidhean staitistigeil a dhearbhadh a’ cleachdadh t-test (td<0.05).Tha na bàraichean a’ riochdachadh meud cuibheasach meristem.(e) Micreascopaidh eadar-aghaidh eadar-theachd eadar-dhealaichte (DIC) de bhunait meristem anns a bheil an structar CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS air a dhath agus air a dhath air sìol-chraobhan 5-latha a dh’ fhàs air lannan MS le no às aonais assay 25 µM KAND.
Chaidh tuilleadh deuchainn a dhèanamh air phytotoxicity KAND 11 le bhith a’ cleachdadh plannt dicotyledonous eile, tombaca (Nicotiana tabacum), agus prìomh fhàs-bheairt de phlanntrais talmhainn, cuislean aibheach (Marchantia polymorpha).Mar a thachair ann an Arabidopsis, thug sìol-chraobhan tombaca SR-1 air fàs air meadhan le 25 μM KAND 11 freumhaichean nas giorra (Fig. 5a).A bharrachd air an sin, bha sìol 40 de 48 a’ germachadh air truinnsearan anns an robh 200 μM KAND 11, ach bha na 48 sìol gu lèir a’ germachadh air meadhanan meallta, a’ nochdadh gu robh dùmhlachdan nas àirde de KAND cudromach (p.<0.05;chi test -square) bacadh air ginideachadh tombaca.(Fig. 5b).A bharrachd air an sin, bha an ìre de KAND 11 a chuir bacadh air fàs bacterial ann an cuislean aibheach coltach ris an ìre èifeachdach ann an Arabidopsis (Fig. 5c).Tha na toraidhean sin a’ nochdadh gum faod KAND 11 bacadh a chur air fàs measgachadh de lusan.Rinn sinn sgrùdadh an uairsin air cytotoxicity comasach air todhar co-cheangailte ri monoamide mathan ann am fàs-bheairtean eile, is e sin ceallan HeLa daonna agus strain Escherichia coli DH5α, mar riochdairean bho cheallan bheathaichean is bacterial nas àirde, fa leth.Ann an sreath de mheasaidhean leudachaidh cealla, chunnaic sinn nach tug coumamonamide 1, searbhag coumamonamidic 6, agus KAND 11 buaidh air fàs cheallan HeLa no E. coli aig dùmhlachdan de 100 μM (Fig. 5d,e).
Bacadh fàs KAND 11 ann am fàs-bheairtean neo-Arabidopsis.(a) Chaidh sìolaidhean tombaca SR-1 de sheòrsa fiadhaich dà sheachdain fhàs air lannan MS air an suidheachadh gu dìreach anns an robh 25 μM KAND 11. (b) Chaidh sìolaidhean tombaca SR-1 de sheòrsa fiadhaich dà sheachdain fhàs air suidheachadh còmhnard Plataichean MS anns a bheil 200 μM KAND 11. (c) Gucagan cuislean aibheach dà sheachdain de sheòrsa fiadhaich Tak-1 air am fàs air truinnsearan Gamborg B5 leis na h-àireamhan comharraichte de KAND 11. ùine.(d) Measadh iomadachadh cealla de cheallan HeLa.Chaidh an àireamh de cheallan obrachail a thomhas aig amannan stèidhichte a’ cleachdadh pasgan cunntais cealla 8 (Dojindo).Mar smachd, chaidh ceallan HeLa a làimhseachadh le 5 μg / ml actinomycin D (Achd D), a chuireas bacadh air tar-sgrìobhadh RNA polymerase agus ag adhbhrachadh bàs cealla.Chaidh mion-sgrùdaidhean a dhèanamh ann an trì-fhillte.(e) Measadh air iomadachadh cealla E. coli.Chaidh fàs E. coli a sgrùdadh le bhith a’ tomhas OD600.Mar smachd, chaidh ceallan a làimhseachadh le 50 μg / ml ampicillin (Amp), a tha a’ bacadh synthesis balla cealla bacterial.Chaidh mion-sgrùdaidhean a dhèanamh ann an trì-fhillte.
Gus faighinn a-mach an dòigh gnìomh de cytotoxicity air adhbhrachadh le todhar co-cheangailte ri uramide, rinn sinn ath-sgrùdadh air toraidhean searbhag urbenic le buaidhean bacaidh meadhanach.mar a chithear san dealbh.Mar a chithear ann am Figearan 2b, 6a, thug sìolaidhean a chaidh fhàs air lannan agar anns an robh dùmhlachdan àrd (200 μM) de dh’ aigéad urmotonic 6 freumhaichean nas giorra agus lùbte clì (θ = - 23.7 ± 6.1), ach de shìol-chraobhan a chaidh fhàs air a ’mheadhan smachd, an bidh sìol-chraobhan a’ toirt a-mach freumhaichean cha mhòr dìreach (θ = - 3.8 ± 7.1).Tha fios gu bheil am fàs oblique sònraichte seo mar thoradh air dysfunction de microtubules cortical14,18.Co-chòrdail ris a’ cho-dhùnadh seo, dh’ adhbhraich na drogaichean mì-sheasmhach microtubule disopyramide agus oryzalin teàrnadh freumhan coltach ris fo na cumhaichean fàis againn (Figs. 2b, 6a).Aig an aon àm, rinn sinn deuchainn air derivatives searbhag urmotonic agus thagh sinn grunn dhiubh a bhrosnaich, aig cuid de cho-chruinneachaidhean, fàs freumh oblique.Dh'atharraich coimeasgaidhean 8, 9, agus 15 an t-slighe airson fàs freumhan aig 75 μM, 50 μM, agus 40 μM, fa leth, a 'sealltainn gum faod na companaidhean sin microtubules a dhì-chothromachadh gu h-èifeachdach (Fig. 2b, 6a).Rinn sinn deuchainn cuideachd air an toradh searbhag ursolic as cumhachdaiche, KAND 11, aig dùmhlachd nas ìsle (15 µM) agus lorg sinn gu robh cleachdadh KAND 11 a’ cur bacadh air fàs freumhan agus gu robh stiùireadh fàs freumha neo-chòmhnard, ged a bha iad buailteach a dhol air an taobh chlì ( Figear C3)..Leis gu bheil dùmhlachdan nas àirde de dhrogaichean mì-sheasmhachd microtubule uaireannan a’ cur bacadh air fàs planntrais seach a bhith ag adhbhrachadh teàrnadh freumhan, rinn sinn measadh às deidh sin air comasachd gun toir KAND 11 buaidh air microtubules le bhith a’ cumail sùil air microtubules cortical ann an ceallan freumh-epidermal.Sheall immunohistochemistry a 'cleachdadh antibodies anti-β-tubulin ann an ceallan epidermal de fhrith-fhrith-rathaidean sìolachaidh a chaidh a làimhseachadh le 25 μM KAND 11 mar a chaidh cha mhòr a h-uile microtubules cortical à bith ann an ceallan epidermal anns an raon leudachaidh (Fig. 6b).Tha na co-dhùnaidhean sin a’ nochdadh gu bheil searbhag kumamotonic agus na toraidhean aige ag obair gu dìreach no gu neo-dhìreach air microtubules gus dragh a chuir orra agus gu bheil na todhar sin nan luchd-dìon microtubule ùr-nodha.
Bidh searbhag Ursonic agus na toraidhean aige ag atharrachadh microtubules cortical ann an Arabidopsis thaliana.(a) Ceàrn claon freumhaich air a thomhas an làthair diofar thoraidhean searbhag urmotonic aig na dùmhlachdan comharraichte.Chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh cuideachd air buaidhean dà choimeasgaidhean ris an canar bacadh microtubules: disopyramide agus oryzalin.Tha an inset a’ sealltainn an ìre a thathar a’ cleachdadh gus ceàrn fàs freumha a thomhas.Tha rionnagan a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh sham (t test, t<0.05).n>19. Bàr sgèile = 1 cm.(b) Microtubules cortical ann an ceallan epidermal anns an raon leudachaidh.Chaidh microtubules ann am freumhan seòrsa fiadhaich Arabidopsis Col a chaidh fhàs air lannan MS le no às aonais 25 μM KAND 11 fhaicinn le staining immunohistochemical a’ cleachdadh antibodies bun-sgoile β-tubulin agus antibodies àrd-sgoile Alexa Fluor-conjugated.Bàr sgèile = 10 µm.(c) Structar mitotach nam microtubules anns a’ bhunait meristem.Chaidh microtubules fhaicinn a’ cleachdadh staining immunohistochemical.Chaidh structaran mitotic, a’ gabhail a-steach sònaichean prophase, dealganan, agus phragmoplasts, a chunntadh bho ìomhaighean confocal.Tha saighdean a’ comharrachadh structaran microtubule mitotic.Tha rionnagan a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh sham (t test, t<0.05).n>9. Bàr sgèile = 50 µm.
Ged a tha comas aig Ursa casg a chuir air gnìomh microtubule, tha dùil gum bi an dòigh gnìomh aige eadar-dhealaichte bho riochdairean depolymerizing microtubule àbhaisteach.Mar eisimpleir, bidh dùmhlachd nas àirde de riochdairean depolymerizing microtubule leithid disopyramide agus oryzalin ag adhbhrachadh leudachadh anisotropic de cheallan epidermal, ach chan eil KAND 11.A bharrachd air an sin, thug co-chur an sàs KAND 11 agus disopyramide freagairt fàs freumhaichte air a bhrosnachadh le disopyramide agus chaidh casg fàis KAND 11-brosnaichte fhaicinn (Fig. S4).Rinn sinn mion-sgrùdadh cuideachd air freagairt an disopyramide hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant gu KAND 11. Phs1-1 tha mùthadh puing tubulin kinase neo-chananach agus bidh e a’ toirt a-mach freumhaichean nas giorra nuair a thèid an làimhseachadh le disopyramide9,20.phs1-1 bha freumhan nas giorra aig sìol-chraobhan mutant a chaidh fhàs air meadhan agar anns an robh KAND 11 coltach ris an fheadhainn a chaidh fhàs air disopyramid (fig. S5).
A bharrachd air an sin, chunnaic sinn structaran microtubule mitotic, leithid sònaichean prophase, dealganan, agus phragmoplasts, ann am freumh meristem sìolaidhean air an làimhseachadh le KAND 11. Co-chòrdail ris na beachdan airson CDKB2; 1p ::CDKB2; 1-GUS, lùghdachadh mòr ann an chaidh an àireamh de mhicrotubules mitotic fhaicinn (Fig. .6c).
Gus comharrachadh cytotoxicity KAND 11 aig rùn subcellular, làimhsich sinn ceallan crochaidh tombaca BY-2 le KAND 11 agus thug sinn sùil air an fhreagairt aca.Chuir sinn KAND 11 ri ceallan BY-2 an-toiseach a’ cur an cèill TagRFP-TUA6, a bhios a’ comharrachadh microtubules gu fluorescent, gus buaidh KAND 11 air microtubules cortical a mheasadh.Chaidh dùmhlachd cortical microtubule a mheasadh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh ìomhaigh, a bha a’ tomhas an àireamh sa cheud de piogsail cytoskeletal am measg piogsail cytoplasmic.Sheall toraidhean an assay, às deidh làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND 11 airson 1 uair, lùghdaich an dùmhlachd gu mòr gu 0.94 ± 0.74% no 0.23 ± 0.28%, fa leth, fhad ‘s a bha dùmhlachd cheallan air an làimhseachadh le DMSO, a’ tighinn gu 1.0.63 ± 1. % (Fig. 7a).Tha na toraidhean sin co-chòrdail ris an amharc ann an Arabidopsis gu bheil làimhseachadh KAND 11 ag adhbhrachadh depolymerization de microtubules cortical (Fig. 6b).Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air loidhne BY-2 le filamentan actin le bileag GFP-ABD às deidh làimhseachadh leis an aon dùmhlachd de KAND 11 agus chunnaic sinn gun do chuir làimhseachadh KAND 11 dragh air na filamentan actin.Lùghdaich làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND 11 airson 1 h gu mòr dùmhlachd filament actin gu 1.20 ± 0.62% no 0.61 ± 0.26%, fa leth, ach bha an dùmhlachd ann an ceallan air an làimhseachadh le DMSO aig 1.69 ± 0.5 2% (F).7b).Tha na toraidhean sin eadar-dhealaichte ri buaidhean propyzamide, nach eil a 'toirt buaidh air filamentan actin, agus latrunculin B, depolymerizer actin nach eil a' toirt buaidh air microtubules (SI Figear S6).A bharrachd air an sin, cha tug làimhseachadh le coumamonamide 1, searbhag coumamonamide 6, no KAND 11 buaidh air microtubules ann an ceallan HeLa (IR Figear S7).Mar sin, thathas a’ creidsinn gu bheil an dòigh-obrach aig KAND 11 eadar-dhealaichte bho luchd-aimhreit aithnichte cytoskeleton.A bharrachd air an sin, nochd ar sgrùdadh microscopach de cheallan BY-2 a chaidh a làimhseachadh le KAND 11 mar a thòisich bàs cealla rè làimhseachadh KAND 11 agus sheall e nach do mheudaich a’ chuibhreann de cheallan marbh le dath gorm Evans gu mòr às deidh 30 min de làimhseachadh KAND 11, ach às deidh 90 mionaidean de làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND, chaidh an àireamh de cheallan marbh suas gu 43.7% no 80.1%, fa leth (Fig. 7c).Air an gabhail còmhla, tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil an toradh ùr ursolic acid KAND 11 na neach-dìon cytoskeletal a tha sònraichte do phlanntaichean le dòigh-obrach neo-aithnichte roimhe seo.
Bidh KAND a’ toirt buaidh air microtubules cortical, filamentan actin, agus comasachd tombaca ceallan BY-2.(a) Amharc air microtubules cortical ann an ceallan BY-2 an làthair TagRFP-TUA6.Chaidh ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le microscopy confocal.Chaidh dùmhlachd cortical microtubule a thomhas bho mhiocrografan de 25 ceallan neo-eisimeileach.Tha litrichean a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra (deuchainn Tukey HSD, td<0.05).Bàr sgèile = 10 µm.(b) Filamentan cortical actin ann an ceallan BY-2 air am faicinn an làthair GFP-ABD2.Chaidh ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le microscopy confocal.Chaidh dùmhlachd filamentan cortical actin a thomhas bho mhiocrografan de 25 ceallan neo-eisimeileach.Tha litrichean a’ nochdadh eadar-dhealachaidhean mòra (deuchainn Tukey HSD, td<0.05).Bàr sgèile = 10 µm.(c) A' coimhead air ceallan marbh BY-2 le Evans staining blue.Chaidh ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le microscopy achaidh soilleir.n=3.Bàr sgèile = 100 µm.
Tha lorg agus cleachdadh thoraidhean nàdarra ùra air leantainn gu adhartas mòr ann an grunn thaobhan de bheatha dhaoine, a’ toirt a-steach cungaidh-leigheis agus àiteachas.Chaidh rannsachadh eachdraidheil a dhèanamh gus todhar feumail fhaighinn bho stòrasan nàdarra.Gu sònraichte, tha fios gu bheil actinomycetes feumail mar antibiotics antiparasitic airson nematodes air sgàth an comas grunn metabolites àrd-sgoile a thoirt gu buil leithid avermectin, am prìomh mheasgachadh de ivermectin agus bleomycin agus na toraidhean aige, air an cleachdadh gu cungaidh-leigheis mar àidseant anticancer21,22.Mar an ceudna, chaidh measgachadh de choimeasgaidhean luibheach a lorg bho actinomycetes, cuid dhiubh air an cleachdadh gu malairteach mar-thà1,23.Mar sin, tha mion-sgrùdadh air metabolites actinomycete gus toraidhean nàdarra a sgaradh le gnìomhan bith-eòlasach a tha thu ag iarraidh air a mheas mar ro-innleachd èifeachdach.Anns an sgrùdadh seo, lorg sinn todhar ùr, coumamonamide, bho S. werraensis agus rinn sinn co-chur gu soirbheachail.Tha searbhag Ursonic na eadar-mheadhan synthetigeach de urbenamide agus na toraidhean aige.Faodaidh e crolaidh freumhan àbhaisteach adhbhrachadh, gnìomhachd luibheach meadhanach gu làidir a nochdadh, agus milleadh a dhèanamh gu dìreach no gu neo-dhìreach air microtubules planntrais.Ach, faodaidh an dòigh gnìomh aig searbhag urmotonic a bhith eadar-dhealaichte bho uidheamachd luchd-dìon microtubule a th’ ann mar-thà, leis gu bheil KAND 11 cuideachd a ’cur dragh air filamentan actin agus ag adhbhrachadh bàs cealla, a’ moladh inneal riaghlaidh leis am bi searbhag urmotonic agus na toraidhean aige a ’toirt buaidh air raon farsaing de structaran cytoskeletal..
Cuidichidh comharrachadh nas mionaidiche air searbhag urbenonic gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air uidheamachd gnìomh searbhag urbenonic.Gu sònraichte, is e an ath amas measadh a dhèanamh air comas searbhag ursonic a bhith a’ ceangal ri microtubules lùghdaichte gus faighinn a-mach a bheil searbhag ursonic agus na toraidhean aige ag obair gu dìreach air microtubules agus gan depolymerize, no a bheil an gnìomh aca a’ leantainn gu dì-sheasmhachd microtubule.A bharrachd air an sin, ann an cùis far nach eil microtubules na thargaid dhìreach, cuidichidh comharrachadh làrach gnìomh agus targaidean moileciuil searbhag ursonic air ceallan planntrais le bhith a’ tuigsinn feartan todhar co-cheangailte agus dòighean a dh’ fhaodadh a bhith ann airson gnìomhachd luibheach a leasachadh.Nochd ar measadh bith-ghnìomhachd an comas cytotoxic sònraichte aig searbhag ursonic air fàs lusan leithid Arabidopsis thaliana, tombaca agus cuislean aibheach, fhad ‘s nach robh buaidh air ceallan E. coli no HeLa.Tha glè bheag de phuinnseanachadh do cheallan bheathaichean na bhuannachd do thoraidhean searbhag ursonic ma thèid an leasachadh mar luibh-bhiastagan airson an cleachdadh ann an raointean àiteachais fosgailte.Gu dearbha, leis gu bheil microtubules nan structaran cumanta ann an eukaryotes, tha an casg roghnach aca ann am planntrais na phrìomh riatanas airson luibhrigean.Mar eisimpleir, thathas a’ cleachdadh propyzamide, àidseant depolymerizing microtubule a bhios a’ ceangal gu dìreach ri tubulin agus a chuireas casg air polymerization, mar luibh-chnàimh air sgàth cho puinnseanta ‘s a tha e do cheallan bheathaichean24.An coimeas ri disopyramide, tha sònrachaidhean targaid eadar-dhealaichte aig benzamides co-cheangailte riutha.A bharrachd air microtubules planntrais, tha RH-4032 no benzoxamide cuideachd a’ cur bacadh air microtubules de cheallan bheathaichean no oomycetes, fa leth, agus tha zalilamide air a chleachdadh mar fhungicide air sgàth cho ìosal ‘s a tha e phytotoxicity25,26,27.Tha am mathan a chaidh a lorg às ùr agus na toraidhean aige a’ nochdadh cytotoxicity roghnach an aghaidh phlanntaichean, ach is fhiach a bhith mothachail gum faodadh atharrachaidhean eile an sònrachas targaid atharrachadh, a dh’ fhaodadh a bhith a’ toirt seachad toraidhean a bharrachd airson smachd a chumail air fungasan pathogenic no oomycetes.
Tha feartan sònraichte searbhag urbenonic agus na toraidhean aige feumail airson an leasachadh mar luibhrigean agus an cleachdadh mar innealan rannsachaidh.Thathas ag aithneachadh cho cudromach sa tha an cytoskeleton ann a bhith a’ cumail smachd air cumadh cealla planntrais.Tha sgrùdaidhean na bu thràithe air sealltainn gu bheil planntaichean air uidheamachdan iom-fhillte de eagrachadh cortical microtubule a leasachadh le bhith a’ cumail smachd air daineamaigs microtubule gus smachd ceart a chumail air morphogenesis.Chaidh àireamh mhòr de mholacilean a tha an urra ri riaghladh gnìomhachd microtubule a chomharrachadh, agus tha rannsachadh co-cheangailte fhathast a 'dol air adhart3,4,28.Chan eil an tuigse a th’ againn an-dràsta air daineamaigs microtubule ann an ceallan planntrais a’ mìneachadh gu h-iomlan na dòighean anns a bheil eagrachadh cortical microtubule.Mar eisimpleir, ged a dh’ fhaodas an dà chuid disopyramide agus oryzalin microtubules a dhì-pholaimeadh, bidh disopyramide ag adhbhrachadh droch shaobhadh freumhach fhad ‘s a tha buaidh caran tlàth aig oryzalin.A bharrachd air an sin, bidh mùthaidhean ann an tubulin, a bhios a ’bunailteachadh microtubules, cuideachd ag adhbhrachadh dextrorotation anns na freumhaichean, ach chan eil paclitaxel, a bhios cuideachd a’ bunailteachadh daineamaigs microtubule.Mar sin, bu chòir sgrùdadh agus comharrachadh targaidean moileciuil searbhag ursolic seallaidhean ùra a thoirt seachad air riaghladh microtubules cortical planntrais.Mar an ceudna, bheir coimeas san àm ri teachd de cheimigean a tha èifeachdach ann a bhith ag adhartachadh fàs air a shaobhadh, leithid disopyramide, agus ceimigean nach eil cho èifeachdach, leithid searbhag oryzalin no kumamotoric, fios air mar a tha fàs air a shaobhadh a’ tachairt.
Air an làimh eile, tha ath-rèiteachaidhean cytoskeletal co-cheangailte ri dìon na chothrom eile air cytotoxicity searbhag ursonach a mhìneachadh.Bidh galar-ghalair no toirt a-steach neach-tarraing a-steach do cheallan planntrais uaireannan ag adhbhrachadh sgrios air an cytoskeleton agus bàs cealla às deidh sin29.Mar eisimpleir, chaidh aithris gu bheil cryptoxanthin stèidhichte air oomycete a’ cur dragh air microtubules agus filamentan actin ro bhàs cealla tombaca, coltach ris na thachras le làimhseachadh KAND30,31.Thug na h-ionannachdan eadar freagairtean dìon agus freagairtean ceallach air an adhbhrachadh le searbhag ursonic sinn a’ smaoineachadh gu bheil iad a’ brosnachadh pròiseasan cealla cumanta, ged a tha buaidh nas luaithe agus nas làidire aig searbhag ursonic na cryptoxanthin ri fhaicinn.Ach, tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil briseadh air filamentan actin ag adhartachadh bàs cealla gun spionnadh, nach eil an-còmhnaidh an cois aimhreit microtubule29.A bharrachd air an sin, tha e fhathast ri fhaicinn a bheil an dàrna cuid am pathogen no an elitor ag adhbhrachadh fàs freumhaich air a shaobhadh, mar a bhios derivatives searbhag ursonic a’ dèanamh.Mar sin, tha eòlas moileciuil a’ ceangal freagairtean dìon agus an cytoskeleton na dhuilgheadas tarraingeach air am feumar dèiligeadh.Le bhith a’ gabhail brath air làthaireachd choimeasgaidhean cuideam moileciuil ìosal co-cheangailte ri searbhag ursonic, a bharrachd air raon de thoraidhean le diofar chomasan, dh’ fhaodadh iad cothroman a thoirt seachad gus cuimseachadh air uidheamachdan cealla neo-aithnichte.
Còmhla, bheir lorg agus cur an sàs todhar ùra a bhios ag atharrachadh daineamaigs microtubule dòighean cumhachdach gus dèiligeadh ris na h-innealan moileciuil iom-fhillte a tha mar bhunait air co-dhùnadh cumadh cealla planntrais.Anns a’ cho-theacsa seo, dh’ fhaodadh an t-searbhag urmotonic toinnte a chaidh a leasachadh o chionn ghoirid, a bheir buaidh air microtubules agus filamentan actin agus a dh’ adhbharaicheas bàs cealla, cothrom a thoirt seachad an ceangal eadar smachd microtubule agus na h-innealan eile sin a mhìneachadh.Mar sin, cuidichidh mion-sgrùdadh ceimigeach agus bith-eòlasach a’ cleachdadh searbhag urbenonic sinn le bhith a’ tuigsinn nan dòighean riaghlaidh moileciuil a tha a’ cumail smachd air cytoskeleton planntrais.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 a-steach do fhlasg Erlenmeyer baffled 500 mL anns a bheil 110 mL de mheadhan sìl air a dhèanamh suas de 2% (w / v) galactose, 2% (w / v) Essence paste, 1% (w / v) Bacto composition .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w / v) earrann arbhair (KOGOSTCH Co., Ltd., Iapan), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 agus 0.2% CaCO3 ann an uisge deionized.(pH 7.4 mus sterilization).Chaidh na cultaran sìl a ghluasad air inneal-crathadh rothlach (180 rpm) aig 27 ° C airson 2 latha.Àiteachadh cinneasachaidh tro choipeadh stàite cruaidh.Chaidh an cultar sìol (7 ml) a ghluasad a-steach do fhlasg 500 ml K-1 anns a bheil 40 g de mheadhan cinneasachaidh air a dhèanamh suas de 15 g de eòrna brùthte (MUSO Co., Ltd., Iapan) agus 25 g de uisge deionized (pH gun atharrachadh). mus sterilization).).Chaidh coipeadh a dhèanamh aig 30 ° C anns an dorchadas airson 14 latha.Chaidh an stuth coipeadh a thoirt a-mach le 40 ml / botal EtOH agus centrifuged (1500 g, 4 ° C, 10 min).Chaidh an supernatant cultair (60 ml) a thoirt a-mach le measgachadh de 10% MeOH / EtoOc.Chaidh an còmhdach organach a ghluasad fo chuideam nas lugha gus fuigheall fhaighinn (59.5 mg), a bha fo smachd HPLC le elution caisead (0-10 mionaidean: 90%) air colbh ìre cùil (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × fad 250 mm) H2O / CH3CN, 10-35 mionaidean: 90% H2O / CH3CN gu 70% H2O / CH3CN (caisead), 35-45 mionaidean: 90% H2O / EtOH, 45-155 mionaidean: 90% H2O /EtOH gu 100% EtOH (caismeachd ( caisead), 155-200 min: 100% EtOH) aig ìre sruth de 1.5 ml / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) air a sgaradh mar phùdar geal amorphous.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ luach àireamhaichte: 141.0659, luach tomhais: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm
Chaidh sìol Columbia (Col-0) fhaighinn bho Ionad Goireasan Bith-eòlais Arabidopsis (ABRC) le cead airson cleachdadh rannsachaidh.Chaidh sìol Col-0 a ghluasad agus a chumail fo chumhachan an obair-lann againn agus a chleachdadh mar phlanntaichean Arabidopsis de sheòrsa fiadhaich.Bha sìol Arabidopsis air a sterilachadh le uachdar agus air a àiteachadh ann am meadhan Murashige agus Skoog leth-neart anns a bheil 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w / v) 2- (4-morpholino) searbhag ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) agus 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, aig 23 ° C agus solas seasmhach.Chaidh sìol an phs1-1 mutant a thoirt seachad le T. Hashimoto (Institiud Saidheans agus Teicneòlais Nara).
Chaidh sìol strain SR-1 a thoirt seachad le T. Hashimoto (Institiud Saidheans agus Teicneòlais Nara) agus air a chleachdadh mar lusan tombaca seòrsa fiadhaich.Bha sìol tombaca air a sterilachadh air uachdar agus air a bogadh ann an uisge steril airson trì oidhcheannan gus ginideachadh a bhrosnachadh, an uairsin a chuir ann am fuasgladh leth-neart anns an robh 2% sucrose, 0.05% (w / v) MES, agus 0.8% guma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.agus Skoog meadhanach) le pH 5.7 agus air a bhrosnachadh aig 23 ° C fo sholas seasmhach.
Chaidh Strain Tak-1 a thoirt seachad le T. Kohchi (Oilthigh Kyoto) agus chaidh a chleachdadh mar an aonad deuchainneach àbhaisteach airson sgrùdadh cuislean aibheach.Chaidh Gemma fhaighinn bho phlanntaichean cultarach sterilized agus an uairsin air an plastadh air meadhan Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) anns an robh 1% sucrose agus 0.3% guma gellan agus air a gortachadh aig 23 ° C fo sholas leantainneach.
Chaidh ceallan tombaca BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) a thoirt seachad le S. Hasezawa (Oilthigh Tokyo).Chaidh ceallan BY-2 a lagachadh 95-fhillte ann am meadhan Linsmeier agus Skoog atharraichte agus chaidh cur ris gach seachdain le searbhag 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 .Chaidh an crochadh cealla a mheasgachadh air crathadh rothlach aig 130 rpm aig 27 ° C anns an dorchadas.Nigh ceallan le 10 tursan nas motha na meadhan ùr agus ath-thòisich san aon mheadhan.Chaidh loidhnichean cealla transgenic BY-2 a chuir an cèill gu seasmhach a ’cur an cèill an comharra microtubule TagRFP-TUA6 no an comharra filament actin GFP-ABD2 fo neach-adhartachaidh bhìoras breac-dhualach muileann 35S mar a chaidh a mhìneachadh33,34,35.Faodar na loidhnichean cealla seo a chumail suas agus a shioncronachadh le bhith a’ cleachdadh mhodhan-obrach coltach ris an fheadhainn a chaidh a chleachdadh airson loidhne cealla tùsail BY-2.
Bha ceallan HeLa air an àiteachadh ann am meadhan Eagle atharraichte Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) le taic bho serum bò fetal 10%, penicillin 1.2 U / ml, agus streptomycin 1.2 μg / ml ann an goireadair 37 ° C le 5% CO2.
Chaidh a h-uile deuchainn a tha air a mhìneachadh san làmh-sgrìobhainn seo a dhèanamh a rèir riaghailtean agus stiùireadh bith-shàbhailteachd Iapanach.
Chaidh todhar a sgaoileadh ann an dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) mar fhuasglaidhean stoc agus air a lagachadh ann am meadhan MS airson Arabidopsis agus tombaca no meadhan Gamborg B5 airson cuislean aibheach.Airson measadh casg fàs freumhan, chaidh còrr air 10 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh na todhar comharraichte no DMSO.Chaidh sìol a thoirt a-steach don t-seòmar fàis airson 7 latha.Chaidh dealbhan a thogail de na sìol-chraobhan agus chaidh fad nam freumhan a thomhas.Airson measadh ginideachadh Arabidopsis, chaidh 48 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh todhar 200 μM no DMSO.Chaidh sìol Arabidopsis fhàs ann an seòmar fàis agus chaidh an àireamh de shìol-chraobhan germinated a chunntadh 7 latha às deidh ginideachadh (dag).Airson measadh ginideachadh tombaca, chaidh 24 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh 200 μM KAND no DMSO.Chaidh sìol tombaca fhàs ann an seòmar fàis agus chaidh an àireamh de shìol-chraobhan germinated a chunntadh às deidh 14 latha.Airson measadh casg fàs lus an ae, chaidh 9 embryons bho gach truinnsear a chuir air meadhan agar anns an robh na cuibhreannan comharraichte de KAND no DMSO agus air an gortachadh ann an seòmar fàis airson 14 latha.
Cleachd sìol-chraobhan air a dhath le 5 mg / ml propidium iodide (PI) gus eagrachadh freumh meristem fhaicinn.Chaidh comharran PI fhaicinn le microscopy fluorescence a’ cleachdadh miocroscop sganaidh laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Chaidh staining histochemical de freumhaichean le β-glucuronidase (GUS) a dhèanamh a rèir a’ phròtacal a mhìnich Malami agus Benfey36.Chaidh sìol-chraobhan a shuidheachadh ann an 90% acetone thar oidhche, air a dhath le searbhag 0.5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ann am bufair GUS airson 1 uair agus air a chuir ann am fuasgladh cloraldehyde hydradach.(8 g chloral hydrate, 2 ml uisge agus 1 ml glycerol) agus air fhaicinn le miocroscop eadar-aghaidh eadar-aghaidh eadar-dhealaichte a’ cleachdadh miocroscop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Chaidh ceàrnan freumhach a thomhas air sìol-chraobhan 7-latha a dh’ fhàs air truinnsearan air an suidheachadh gu dìreach.Tomhais ceàrn a’ bhunait bho stiùireadh an vectar grabhataidh mar a chaidh a mhìneachadh ann an ceum 6.
Chaidh sùil a chumail air rèiteachadh microtubules cortical mar a chaidh a mhìneachadh, le mion-atharrachaidhean air a’ phròtacal 37 .Chaidh antibody anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) agus IgG an-aghaidh luchag le Alexa Fluor 488-conjugated (Thermo Fisher Scientific: A32723) a chleachdadh mar antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile aig 1: 1000 agus lagachadh 1: 100, fa leth.Chaidh ìomhaighean fluorescence fhaighinn a’ cleachdadh miocroscop sganaidh laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Faigh ìomhaighean Z-stack agus cruthaich ro-mheasaidhean dian as àirde a rèir stiùireadh an neach-dèanamh.
Chaidh assay lionn cealla HeLa a dhèanamh a’ cleachdadh Cell Counting Kit 8 (Dojindo) a rèir stiùireadh an neach-dèanamh.
Chaidh fàs E. coli DH5α a sgrùdadh le bhith a 'tomhas dùmhlachd cealla ann an cultar a' cleachdadh spectrphotometer aig 600 nm (OD600).
Chaidh eagrachadh cytoskeletal ann an ceallan transgenic BY-2 fhaicinn a’ cleachdadh miocroscop flùraiseach uidheamaichte le inneal sganaidh confocal CSU-X1 (Yokogawa) agus camara sCMOS (Zyla, Andor Technology).Chaidh dùmhlachd cytoskeletal a mheasadh le mion-sgrùdadh ìomhaigh, a rinn tomhas air an àireamh sa cheud de piogsail cytoskeletal am measg piogsail cytoplasmic ann an ìomhaighean confocal a’ cleachdadh bathar-bog ImageJ mar a chaidh a mhìneachadh38,39.
Gus bàs cealla ann an ceallan BY-2 a lorg, chaidh cuibhreann den chasg cealla a thoirt a-steach le 0.05% Evans gorm airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair.Tha dathadh gorm roghnach Evans de cheallan marbh an urra ri bhith a’ toirt a-mach an dath bho cheallan obrachail leis an membran plasma iomlan40.Chaidh ceallan dhathte fhaicinn a’ cleachdadh miocroscop achaidh soilleir (BX53, Olympus).
Chaidh ceallan HeLa fhàs ann an DMEM le taic bho 10% FBS ann an goireadair tais aig 37 ° C agus 5% CO2.Chaidh ceallan a làimhseachadh le 100 μM KAND 11, aigéad kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), no 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) airson 6 h aig 37 ° C.Chaidh ceallan a shuidheachadh le MetOH airson 10 min agus an uairsin le acetate airson 5 min aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh ceallan stèidhichte a thoirt a-steach le antibody bun-sgoile β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) air a lagachadh ann an 0.5% BSA / PBS airson 2 uair, air an nighe 3 tursan le TBST, agus an uairsin air an gortachadh le antibody gobhar Alexa Fluor.488 1 uair.- Luchag IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) agus 15 ng / ml 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) air a lagachadh ann an 0.5% BSA / PBS.Às deidh nighe le TBST trì tursan, chaidh ceallan dhathte fhaicinn air miocroscop inverted Nikon Eclipse Ti-E.Chaidh dealbhan a ghlacadh le camara Hamamatsu ORCA-R2 CCD air fhuarachadh a’ cleachdadh bathar-bog MetaMorph (Innealan Molecular).
Ùine puist: Jun-17-2024