Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach den bhrobhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson na toraidhean as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu dreach nas ùire den bhrobhsair agad (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, tha sinn a’ sealltainn an làraich gun stoidhle no JavaScript.
Faodaidh lorg agus cleachdadh buannachdail thoraidhean nàdarra cuideachadh le bhith a’ leasachadh beatha dhaoine. Tha ceimigean a chuireas bacadh air fàs planntrais air an cleachdadh gu farsaing mar luibh-mharbhaichean gus luibhean a smachdachadh. Air sgàth an fheum air diofar sheòrsaichean luibh-mharbhaichean a chleachdadh, tha feum air todhar a chomharrachadh le dòighean gnìomh ùra. Anns an sgrùdadh seo, lorg sinn todhar ùr N-alkoxypyrrole, coumamonamide, bho Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus stèidhich sinn am pròiseas co-chur iomlan. Tro dheuchainnean gnìomhachd bith-eòlasach, lorg sinn gur e eadar-mheadhanair synthetigeach de urs-monoamide a th’ ann an searbhag urs-monoamic agus comas…casg fàs lusanA bharrachd air an sin, tha sinn air diofar thoradh searbhag urbenonic a leasachadh, a’ gabhail a-steach an toradh urbenyloxy (UDA), aig a bheil gnìomhachd luibh-mharbhtach àrd gun droch bhuaidh a thoirt air fàs cheallan HeLa. Fhuair sinn a-mach cuideachd gu bheil toraidhean searbhag urmotonic a’ cur dragh air microtubules planntrais; a bharrachd air an sin, bidh KAND a’ toirt buaidh air filamentan actin agus ag adhbhrachadh bàs cealla; Tha na buaidhean ioma-thaobhach seo eadar-dhealaichte bho na buaidhean a th’ aig luchd-bacadh microtubule aithnichte agus a’ moladh dòigh-obrach ùr airson searbhag ursonic, a tha a’ riochdachadh buannachd chudromach ann an leasachadh luibh-mharbhadairean ùra.
Tha lorg agus cleachdadh practaigeach thoraidhean nàdarra buannachdail agus na toraidhean aca na dhòigh air càileachd beatha dhaoine a leasachadh. Tha metabolites àrd-sgoile air an dèanamh le meanbh-fhàs-bheairtean, lusan agus biastagan air leantainn gu adhartasan mòra ann an leigheas agus àiteachas. Chaidh mòran antibiotics agus drogaichean an-aghaidh leucemia a leasachadh bho thoraidhean nàdarra. A bharrachd air an sin, diofar sheòrsaichean depuinnseanan-bhiastagan, tha fungais-mharbhaichean agus luibh-mharbhaichean air an toirt a-mach às na toraidhean nàdarra seo airson an cleachdadh ann an àiteachas. Gu sònraichte, tha luibh-mharbhaichean smachd luibhean nan innealan cudromach airson toradh bàrr a mheudachadh ann an àiteachas an latha an-diugh, agus tha diofar sheòrsaichean de choimeasgaidhean air an cleachdadh gu malairteach mu thràth. Thathas a’ meas grunn phròiseasan ceallach ann an lusan, leithid foto-co-chur, metabolism amino-aigéid, co-chur balla cealla, riaghladh mitosis, comharran phytohormone, no co-chur pròtain, mar thargaidean àbhaisteach de luibh-mharbhaichean. Tha coimeasgaidhean a chuireas bacadh air gnìomh microtubule nan clas cumanta de luibh-mharbhaichean a bheir buaidh air fàs lusan le bhith a’ toirt buaidh air riaghladh mitotic2.
Tha microtubules nam pàirtean den cytoskeleton agus tha iad air an glèidheadh gu farsaing ann an ceallan eukaryotic. Tha an heterodimer tubulin air a dhèanamh suas de α-tubulin agus β-tubulin a’ cruthachadh protofilaments microtubule loidhneach, le 13 protofilaments a’ cruthachadh structar siolandair. Bidh microtubules a’ cluich iomadh dreuchd ann an ceallan planntrais, a’ gabhail a-steach a bhith a’ dearbhadh cumadh cealla, roinneadh cealla, agus còmhdhail intracellular3,4. Tha microtubules ann an ceallan planntrais fon membran plasma eadar-raoin, agus thathas a’ smaoineachadh gu bheil na microtubules cortical sin a’ cumail smachd air eagrachadh microfibrils ceallalose tro riaghladh iom-fhilltean synthase ceallalose4,5. Tha microtubules cortical de cheallan epidermal freumha, a tha an làthair anns an raon sìneadh luath de bharr na freumha, suidhichte gu taobhach, agus bidh microfibers ceallalose a’ leantainn nam microtubules sin agus a’ cuingealachadh stiùireadh leudachadh cealla, agus mar sin a’ brosnachadh sìneadh cealla anisotropic. Mar sin, tha gnìomh microtubule ceangailte gu dlùth ri morf-eòlas planntrais. Bidh ionadachadh amino-aigéid ann an ginean a tha a’ còdachadh tubulin ag adhbhrachadh claonadh ann an sreathan microtubule cortical agus fàs air an taobh chlì no air an taobh dheas ann an Arabidopsis 6,7. San aon dòigh, faodaidh mùthaidhean ann am pròtainean co-cheangailte ri microtubule a bhios a’ riaghladh daineamaigs microtubule leantainn gu fàs freumha air a shaobhadh 8,9,10,11,12,13. A bharrachd air an sin, bidh làimhseachadh le luibh-mharbhaichean a bhios a’ cur dragh air microtubule leithid disopyramide, ris an canar cuideachd pretilachlor, cuideachd ag adhbhrachadh fàs freumha claon air an taobh chlì 14. Tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil riaghladh mionaideach air gnìomh microtubule deatamach airson stiùireadh fàs planntrais a dhearbhadh.
Chaidh diofar sheòrsaichean de luchd-bacadh microtubule a lorg, agus tha na drogaichean seo air cur gu mòr ri rannsachadh cytoskeletal, a bharrachd air àiteachas agus leigheas2. Gu sònraichte, faodaidh oryzalin, todhar dinitroaniline, disopyramide, todhar co-cheangailte ri benzamide, agus na h-analogan aca casg a chuir air gnìomhachd microtubule agus mar sin casg a chuir air fàs planntrais. Mar sin, tha iad air an cleachdadh gu farsaing mar luibh-mharbhaichean. Ach, leis gu bheil microtubules nam pàirt chudromach de cheallan planntrais is bheathaichean, tha a’ mhòr-chuid de luchd-bacadh microtubule cytotoxic don dà sheòrsa cealla. Mar sin, a dh’ aindeoin an fheumalachd aithnichte mar luibh-mharbhaichean, thathas a’ cleachdadh àireamh chuingealaichte de riochdairean an-aghaidh microtubule airson adhbharan practaigeach.
'S e genus den teaghlach Streptomyces a th' ann an Streptomyces, anns a bheil bacteria aerobic, gram-positive, filamentous agus tha e ainmeil airson a chomas raon farsaing de metabolites àrd-sgoile a thoirt gu buil. Mar sin, thathas ga mheas mar aon de na stòran as cudromaiche de thoraidhean nàdarra ùra gnìomhach gu bith-eòlasach. Anns an sgrùdadh làithreach, lorg sinn todhar ùr ris an canar coumamonamide, a chaidh a sgaradh bho Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus S. werraensis ISP 5486. A’ cleachdadh mion-sgrùdadh speactram agus làn mhion-sgrùdadh speactram, chaidh structar coumamonamide a chomharrachadh agus chaidh a chnàimhneach N-alkoxypyrrole sònraichte a dhearbhadh. Chaidh a lorg gu bheil searbhag ursmonic, eadar-mheadhanair synthetigeach de ursmonoamide agus na toraidhean aige, a’ cur bacadh air fàs agus ginideachadh a’ phlannt mhodail mòr-chòrdte Arabidopsis thaliana. Ann an sgrùdadh dàimh structar-gnìomhachd, fhuair sinn a-mach gu bheil todhar le C9 air atharrachadh gu searbhag ursonic, ris an canar nonyloxy derivative de dh’ aigéad ursonic (KAND), a’ neartachadh gu mòr a’ bhuaidh bacaidh air fàs agus ginideachadh. Gu sònraichte, thug an casg-fàs planntrais a chaidh a lorg às ùr buaidh cuideachd air fàs tombaca agus lus an grùthan agus cha robh e cytotoxic do bacteria no ceallan HeLa. A bharrachd air an sin, bidh cuid de dh’fhuasglaidhean searbhag urmotonic ag adhbhrachadh phenotype freumha air a shaobhadh, a’ ciallachadh gu bheil na toraidhean sin a’ toirt buaidh dhìreach no neo-dhìreach air microtubules. A rèir a’ bheachd seo, tha na beachdan againn air microtubules air an comharrachadh an dàrna cuid gu immunohistochemically no le pròtainean fluorescent a’ nochdadh gu bheil làimhseachadh KAND a’ dì-phoilimearachadh microtubules. A bharrachd air an sin, bidh làimhseachadh le toraidhean searbhag kumamotonic a’ cur dragh air microfilaments actin. Mar sin, tha sinn air casg-fàs planntrais ùr a lorg aig a bheil dòigh-obrach sònraichte a’ toirt a-steach sgrios an cytoskeleton.
Chaidh an seòrsa MK493-CF1 a sgaradh bhon ùir ann an Shinagawa-ku, Tokyo. Chruthaich an seòrsa MK493-CF1 mycelium stromal le deagh mheuran. Chaidh sreath pàirteach a’ ghine RNA ribosomal 16S (1422 bp) a dhearbhadh. Tha an seòrsa seo glè choltach ri S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: seòrsa àbhaisteach, 99.93%). Stèidhichte air an toradh seo, chaidh a dhearbhadh gu robh an seòrsa seo dlùth-cheangailte ris an t-seòrsa seòrsa de S. werraensis. Mar sin, thug sinn an t-ainm S. werraensis MK493-CF1 air a’ ghnè seo gu sealadach. Bidh S. werraensis ISP 5486T cuideachd a’ dèanamh nan aon choimeasgaidhean bith-ghnìomhach. Leis nach robh mòran rannsachaidh tràth ann a thaobh faighinn thoraidhean nàdarra bhon meanbh-fhàs-bheairt seo, chaidh tuilleadh rannsachaidh ceimigeach a dhèanamh. Às dèidh àiteachadh S. werraensis MK493-CF1 air meadhan eòrna le coipeadh staid chruaidh aig 30°C airson 14 latha, chaidh am meadhan a thoirt a-mach le 50% EtOH. Chaidh 60 ml den sampall a thiormachadh gus 59.5 mg de earrann amh fhaighinn. Chaidh an earrann amh a chur fo HPLC ìre cùil gus N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, air a bheil coumamonamide, 36.0 mg) a thoirt seachad. Tha an ìre iomlan de 1 timcheall air 60% den earrann amh. Mar sin, chuir sinn romhainn sgrùdadh mionaideach a dhèanamh air feartan kumamotoamide 1.
Is e pùdar geal neo-chruthach a th’ ann an Coumamonamide 1 agus tha speactramaitreachd mais àrd-rèiteachaidh (HRESIMS) a’ dearbhadh C6H8N2O2 (Figear 1). Tha am pìos pirrole le ionad C2 den cho-thàthadh seo air a chomharrachadh le δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ann an speactram 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) agus δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), agus tha speactram 13C NMR a’ sealltainn làthaireachd ceithir dadaman gualain sp2. Chaidh làthaireachd buidheann amide aig suidheachadh C2 a mheasadh le co-dhàimh HMBC bhon phròton C-3 chun charbon carbonyl amide aig δC 161.1. A bharrachd air sin, tha prìomh thaisbeanaidhean NMR 1H agus 13C aig δH 4.10 (3H, S) agus δC 68.3 a’ comharrachadh gu bheil buidhnean N-methoxy an làthair anns a’ mholaciul. Ged nach deach suidheachadh ceart a’ bhuidheann methoxy a dhearbhadh fhathast le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh speactroscopach leithid speactroscopaidh eadar-dhealachaidh leasaichte agus giorrachadh niùclasach Overhauser (NOEDF), b’ e N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide a’ chiad cho-thàth a chaidh a thaghadh.
Gus structar ceart 1 a dhearbhadh, chaidh co-chur iomlan a dhèanamh (Figear 2a). Mar thoradh air làimhseachadh 2-aminopyridine 2 a tha ri fhaighinn gu malairteach le m-CPBA, fhuaireadh an N-ocsaid 3 co-fhreagarrach ann an toradh cainneachdail. Às dèidh 2-aminoazidation de 2, chaidh an ath-bhualadh cyclocondensation a mhìnich Abramovich a dhèanamh ann am beinséin aig 90°C gus an 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 a bha a dhìth fhaighinn ann an graman. Astar 60% (dà ìre). 15,16. An uairsin thug methylation agus hydrolysis de 4 searbhag 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (ris an canar “searbhag cumotonic”, 6) ann an toradh math (70%, dà cheum). Mu dheireadh, thug amidation tro eadar-mheadhanair clòraid searbhag 6 a’ cleachdadh ammonia uisgeach Kumamoto amide 1 ann an toradh 98%. Bha a h-uile dàta speactram de 1 co-chur coltach ri 1 aonaranach, agus mar sin chaidh structar 1 a dhearbhadh;
Co-chur coitcheann agus mion-sgrùdadh air gnìomhachd bhitheolach urbenamide agus searbhag urbenic. (a) Co-chur iomlan de Kumamoto amide. (b) Chaidh sìol-chraobhan Arabidopsis Columbia (Col) fiadhaich seachd latha a dh'aois fhàs air pleitean Murashige agus Skoog (MS) anns an robh coumamonamide 6 no coumamonamide 1 aig na dùmhlachdan a chaidh a chomharrachadh. Bàr sgèile = 1 cm.
An toiseach, rinn sinn measadh air gnìomhachd bhitheolach urbenamide agus na h-eadar-mheadhanairean aige airson an comas fàs planntrais atharrachadh. Chuir sinn diofar cho-chruinneachaidhean de ursmonamide 1 no searbhag ursmonic 6 ri meadhan agar MS agus chuir sinn sìol-chraobhan Arabidopsis thaliana ann an àite a’ mheadhain seo. Sheall na deuchainnean seo gun robh dùmhlachdan àrda (500 μM) de 6 a’ cur bacadh air fàs freumhaichean (Figear 2b). An uairsin, chruthaich sinn diofar thoradh le bhith a’ cur suidheachadh N1 de 6 an àite a chèile agus rinn sinn sgrùdaidhean dàimh structar-gnìomhachd orra (tha am pròiseas co-chur analogach air a mhìneachadh anns an Fhiosrachadh Taice (SI)). Chaidh sìol-chraobhan Arabidopsis fhàs air meadhan anns an robh 50 μM de thoradh searbhag ursonic, agus chaidh fad na freumha a thomhas. mar a chithear san dealbh. Mar a chithear ann am Figearan 3a, b, agus S1, tha diofar fhaid de shlabhraidhean alcoxy loidhneach (9, 10, 11, 12, agus 13) no slabhraidhean alcoxy mòra (15, 16, agus 17) aig searbhagan coumamo aig suidheachadh N1. Sheall na toraidhean bacadh mòr air fàs freumhaichean. A bharrachd air sin, fhuair sinn a-mach gun do chuir cur 200 μM de 10, 11, no 17 bacadh air ginideachadh (Figearan 3c agus S2).
Sgrùdadh air a’ cheangal structar-gnìomhachd aig Kumamoto amide agus todhar co-cheangailte. (a) Sgeama structar agus co-chur analogs. (b) Meudachadh fad freumha sìol-chraobhan 7 latha a dh'aois a chaidh fhàs air meadhan MS le no às aonais toraidhean coumamonamide 50 μM. Tha reultan a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean cudromach le làimhseachadh meallta (deuchainn t, p< 0.05). n>18. Tha dàta air a shealltainn mar chuibheasachd ± SD. Tha nt a’ ciallachadh “gun deuchainn” leis nach do ghineadh barrachd air 50% de na sìol. (c) Meudachadh air ìre ginideachaidh sìol air an làimhseachadh air an goir airson 7 latha ann am meadhan MS le no às aonais 200 μM coumamonamide agus todhar co-cheangailte. Tha reultan a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh meallta (deuchainn chi-ceàrnagach). n=96.
Gu inntinneach, lùghdaich cur-ris slabhraidhean taobh alcail nas fhaide na C9 an gnìomhachd bacaidh, a’ moladh gum feum co-thàthaidhean co-cheangailte ri searbhag kumamotoic slabhraidhean taobh de mheud sònraichte gus an gnìomhachd bhitheòlasach aca a nochdadh.
Leis gun do sheall mion-sgrùdadh air a’ cheangal eadar structar is gnìomhachd gun deach C9 atharrachadh gu searbhag ursonach agus gur e an toradh nonyloxy de dh’aigéad ursonach (ris an canar KAND 11 an-seo às dèidh seo) an casg-fàs planntrais as èifeachdaiche, rinn sinn sgrùdadh nas mionaidiche air KAND 11. Chuir làimhseachadh Arabidopsis le 50 μM KAND 11 casg cha mhòr gu tur air ginideachadh, ach chuir dùmhlachdan nas ìsle (40, 30, 20, no 10 μM) de KAND 11 casg air fàs freumhaichean ann an dòigh a bha an urra ris an dòs (Figear 4a, b). Gus deuchainn a dhèanamh a bheil KAND 11 a’ toirt buaidh air beòshlaint meristem freumhaichean, rinn sinn sgrùdadh air meristems freumhaichean air an dath le propidium iodide (PI) agus thomhais sinn meud farsaingeachd meristem. B’ e 151.1 ± 32.5 μm meud meristem nan sìol-chraobhan a chaidh fhàs air meadhan anns an robh 25 μM KAND-11, agus b’ e 264.7 ± 30.8 μm meud meristem nan sìol-chraobhan a chaidh fhàs air meadhan smachd anns an robh DMSO (Figear 4c, d), a tha a’ nochdadh gu bheil KAND-11 ag ath-nuadhachadh gnìomhachd cealla. sgaoileadh. Meristem freumha. A rèir seo, lughdaich làimhseachadh KAND 11 meud an comharra roinneadh cealla CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ann am meristem na freumha (Figear 4e) 17. Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gu bheil KAND 11 a’ cur bacadh air fàs freumha le bhith a’ lughdachadh gnìomhachd iomadachadh cheallan.
Mion-sgrùdadh air buaidh bacaidh toraidhean searbhag urbenonic (toraidhean urbenyloxy) air fàs. (a) Sìol-chraobhan Col fiadhaich 7 latha a dh'aois air am fàs air truinnsearan MS leis na dùmhlachdan ainmichte de KAND 11. Bàr sgèile = 1 cm. (b) Meudachadh fad freumha. Tha litrichean a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean cudromach (deuchainn Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Tha dàta air a shealltainn mar chuibheasachd ± SD. (c) Miocroscopaidh confocal de fhreumhan Col fiadhaich air an dath le propidium iodide air am fàs air pleitean MS le no às aonais 25 μM KAND 11. Tha camagan geala a’ comharrachadh meristem freumha. Bàr sgèile = 100 µm. (d) Meudachadh meud meristem freumha (n = 10 gu 11). Chaidh eadar-dhealachaidhean staitistigeil a dhearbhadh a’ cleachdadh deuchainn-t (p< 0.05). Tha na bàraichean a’ riochdachadh meud cuibheasach a’ meristeim. (e) Mìcroscopaidh eadar-dhealachaidh eadar-theachd eadar-dhealaichte (DIC) de meristem freumha anns a bheil an togail CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS air a dhath agus air a dhath air sìol-chraobhan 5 latha a dh'aois air an fàs air pleitean MS le no às aonais deuchainn KAND 25 µM.
Chaidh deuchainn a dhèanamh air puinnseanta KAND 11 a thaobh phyto-tocsaineachd le bhith a’ cleachdadh lus dà-chotailedonach eile, tombaca (Nicotiana tabacum), agus prìomh fhàs-bheairt modail lus talmhainn, lus an grùthan (Marchantia polymorpha). Mar a thachair le Arabidopsis, thug sìol-chraobhan tombaca SR-1 a chaidh fhàs air meadhan anns an robh 25 μM KAND 11 freumhaichean nas giorra (Figear 5a). A bharrachd air an sin, dh’fhàs 40 de 48 sìol air truinnsearan anns an robh 200 μM KAND 11, ach dh’fhàs na 48 sìol uile air meadhanan air an làimhseachadh le magadh, a’ nochdadh gu robh dùmhlachdan nas àirde de KAND cudromach (p< 0.05; deuchainn chi -ceàrnagach) a’ cur bacadh air germachadh tombaca. (Figear 5b). A bharrachd air an sin, bha dùmhlachd KAND 11 a chuir bacadh air fàs bacteriach ann an lus an grùthan coltach ris an dùmhlachd èifeachdach ann an Arabidopsis (Figear 5c). Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gum faod KAND 11 fàs measgachadh de lusan a chasg. An uairsin rinn sinn sgrùdadh air comas cito-tocsaineachd choimeasgaidhean co-cheangailte ri monoamide mathan ann am fàs-bheairtean eile, is iad sin ceallan HeLa daonna agus sreath Escherichia coli DH5α, mar riochdairean de cheallan bheathaichean is bacteriach nas àirde, fa leth. Ann an sreath de dheuchainnean iomadachadh cheallan, mhothaich sinn nach robh buaidh aig coumamonamide 1, searbhag coumamonamidic 6, agus KAND 11 air fàs cheallan HeLa no E. coli aig dùmhlachdan de 100 μM (Figear 5d,e).
Bacadh fàis KAND 11 ann am fàs-bheairtean neo-Arabidopsis. (a) Chaidh sìol-chraobhan tombaca SR-1 seòrsa fiadhaich dà sheachdain a dh'aois fhàs air pleitean MS suidhichte gu dìreach anns an robh 25 μM KAND 11. (b) Chaidh sìol-chraobhan tombaca SR-1 seòrsa fiadhaich dà sheachdain a dh'aois fhàs air pleitean MS suidhichte gu còmhnard anns an robh 200 μM KAND 11. (c) Gucagan cuisle grùthan Tak-1 seòrsa fiadhaich dà sheachdain a dh'aois air am fàs air pleitean Gamborg B5 leis na dùmhlachdan ainmichte de KAND 11. Tha saighdean dearga a’ comharrachadh spòran a sguir a’ fàs taobh a-staigh na h-ùine goir dà sheachdain. (d) Deuchainn iomadachadh cheallan de cheallan HeLa. Chaidh àireamh nan ceallan beò a thomhas aig amannan stèidhichte a’ cleachdadh pasgan cunntaidh cheallan 8 (Dojindo). Mar smachd, chaidh ceallan HeLa a làimhseachadh le 5 μg / ml actinomycin D (Act D), a chuireas bacadh air tar-sgrìobhadh RNA polymerase agus ag adhbhrachadh bàs cealla. Chaidh mion-sgrùdaidhean a dhèanamh ann an trì leth-bhreac. (e) Deuchainn iomadachadh cheallan E. coli. Chaidh fàs E. coli a sgrùdadh le bhith a’ tomhas OD600. Mar smachd, chaidh na ceallan a làimhseachadh le 50 μg/ml ampicillin (Amp), a chuireas bacadh air co-chur ballachan cealla bacteriach. Rinneadh trì mion-sgrùdaidhean.
Gus mìneachadh a dhèanamh air mar a bhios puinnseanta air adhbhrachadh le todhar co-cheangailte ri uramide, rinn sinn ath-sgrùdadh air toraidhean searbhag urbenic le buaidhean bacaidh meadhanach, mar a chithear san dealbh. Mar a chithear ann am Figearan 2b, 6a, thug sìol-chraobhan a chaidh fhàs air pleitean agar anns an robh dùmhlachdan àrda (200 μM) de dh’aigéad urmotonic 6 freumhaichean nas giorra agus lùbte gu clì (θ = – 23.7 ± 6.1), ach a thaobh sìol-chraobhan a chaidh fhàs air a’ mheadhan smachd, thug na sìol-chraobhan freumhaichean cha mhòr dìreach (θ = – 3.8 ± 7.1). Tha fios gu bheil an fhàs claon sònraichte seo mar thoradh air mì-ghnìomhachd microtubules cortical14,18. A rèir an lorg seo, dh’ adhbhraich na drogaichean neo-sheasmhach microtubule disopyramide agus oryzalin claonadh freumha coltach ris fo na cumhaichean fàis againn (Figearan 2b, 6a). Aig an aon àm, rinn sinn deuchainn air toraidhean searbhag urmotonic agus thagh sinn grunn dhiubh a bhrosnaich fàs freumha claon aig dùmhlachdan sònraichte. Dh’atharraich todhar 8, 9, agus 15 stiùireadh fàs freumhaichean aig 75 μM, 50 μM, agus 40 μM, fa leth, a’ nochdadh gum faod na todhar sin meanbh-thubulan a dhì-chothromachadh gu h-èifeachdach (Figear 2b, 6a). Rinn sinn deuchainn cuideachd air an t-searbhag ursolach as cumhachdaiche, KAND 11, aig dùmhlachd nas ìsle (15 µM) agus fhuair sinn a-mach gun do chuir cleachdadh KAND 11 bacadh air fàs freumhaichean agus gu robh stiùireadh fàs freumhaichean neo-chothromach, ged a bha iad buailteach a bhith a’ lùbadh chun na clì (Figear C3). . Leis gu bheil dùmhlachdan nas àirde de dhrogaichean a chuireas meanbh-thubulan an aghaidh seasmhachd uaireannan a’ cur bacadh air fàs planntrais seach a bhith ag adhbhrachadh claonadh freumhaichean, rinn sinn measadh às deidh sin air a’ chomas gum bi KAND 11 a’ toirt buaidh air meanbh-thubulan le bhith a’ cumail sùil air meanbh-thubulan cortical ann an ceallan epidermal freumhaichean. Sheall immunohistochemistry a’ cleachdadh antibodies an-aghaidh β-tubulin ann an ceallan epidermal freumhaichean sìol-chraobhan air an làimhseachadh le 25 μM KAND 11 gun deach cha mhòr a h-uile meanbh-thubulan cortical à bith ann an ceallan epidermal anns an raon sìneadh (Figear 6b). Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gu bheil searbhag kumamotonic agus a thoradh ag obair gu dìreach no gu neo-dhìreach air microtubules gus an cur às a chèile agus gu bheil na todhar sin nan luchd-bacadh microtubule ùra.
Bidh searbhag ursonach agus na toraidhean aige ag atharrachadh microtubules cortical ann an Arabidopsis thaliana. (a) Ceàrn claonadh freumha air a thomhas an làthair diofar thoradh searbhag urmotonic aig na dùmhlachdan a chaidh a chomharrachadh. Chaidh buaidhean dà cho-thàth a tha aithnichte airson casg a chuir air microtubules: disopyramide agus oryzalin a sgrùdadh cuideachd. Tha an inset a’ sealltainn an ìre àbhaisteach a thathas a’ cleachdadh gus ceàrn fàis freumha a thomhas. Tha reultan a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean mòra le làimhseachadh sham (deuchainn t, p< 0.05). n>19. Bàr-sgèile = 1 cm. (b) Microtubules cortical ann an ceallan epidermal anns an raon sìneadh. Chaidh microtubules ann am freumhaichean Arabidopsis Col fiadhaich a chaidh fhàs air pleitean MS le no às aonais 25 μM KAND 11 a shamhlachadh le bhith a’ dathadh immunohistochemical a’ cleachdadh antibodies bun-sgoile β-tubulin agus antibodies àrd-sgoile ceangailte ri Alexa Fluor. Bàr-sgèile = 10 µm. (c) Structar mitotic de microtubules ann am meristem na freumha. Chaidh microtubules a shamhlachadh le bhith a’ cleachdadh dathadh immunohistochemical. Chaidh structaran mitotic, a’ gabhail a-steach raointean prophase, dealganan, agus phragmoplasts, a chunntadh bho ìomhaighean confocal. Tha saighdean a’ comharrachadh structaran microtubule mitotic. Tha reultan a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean cudromach le làimhseachadh sham (deuchainn t, p< 0.05). n>9. Bàr-sgèile = 50 µm.
Ged a tha comas aig Ursa gnìomhachd microtubule a bhriseadh, thathar an dùil gum bi an dòigh-obrach aige eadar-dhealaichte bho riochdairean dì-phoilimearachaidh microtubule àbhaisteach. Mar eisimpleir, bidh dùmhlachdan nas àirde de riochdairean dì-phoilimearachaidh microtubule leithid disopyramide agus oryzalin ag adhbhrachadh leudachadh anisotropic de cheallan epidermal, ach chan eil KAND 11. A bharrachd air an sin, dh’ adhbhraich co-chur KAND 11 agus disopyramide freagairt fàs freumha còmhla air a bhrosnachadh le disopyramide agus chaidh casg fàis air adhbhrachadh le KAND 11 fhaicinn (Figear S4). Rinn sinn mion-sgrùdadh cuideachd air freagairt a’ mutant disopyramide 1-1 (phs1-1) ro-mhothachail ri KAND 11. Tha mùthadh puing kinase tubulin neo-chanònach aig phs1-1 agus bidh e a’ toirt a-mach freumhaichean nas giorra nuair a thèid a làimhseachadh le disopyramide9,20. Bha freumhaichean nas giorra aig sìol-chraobhan mutant phs1-1 a chaidh fhàs air meadhan agar anns an robh KAND 11 coltach ris an fheadhainn a chaidh fhàs air disopyramid (figear S5).
A bharrachd air an sin, chunnaic sinn structaran microtubule mitotic, leithid sònaichean prophase, spindles, agus phragmoplasts, ann am meristem freumhach sìol-chraobhan a chaidh a làimhseachadh le KAND 11. A rèir nan amharc airson CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, chaidh lùghdachadh mòr fhaicinn ann an àireamh nam microtubules mitotic (Figear .6c).
Gus cito-tocsaineachd KAND 11 a chomharrachadh aig rùn fo-cheallach, làimhsich sinn ceallan crochaidh tombaca BY-2 le KAND 11 agus choimhead sinn air an fhreagairt. An toiseach, chuir sinn KAND 11 ri ceallan BY-2 a’ cur an cèill TagRFP-TUA6, a bhios a’ comharrachadh microtubules gu fluorescent, gus measadh a dhèanamh air buaidh KAND 11 air microtubules cortical. Chaidh dùmhlachd microtubule cortical a mheasadh le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh ìomhaighean, a thomhais ceudad de piogsail cytoskeletal am measg piogsail cytoplasmic. Sheall toraidhean an deuchainn, às deidh làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND 11 airson 1 uair, gun do lùghdaich an dùmhlachd gu mòr gu 0.94 ± 0.74% no 0.23 ± 0.28%, fa leth, agus gun robh dùmhlachd nan ceallan air an làimhseachadh le DMSO aig 1.61 ± 0.34% (Figear 7a). Tha na toraidhean seo a rèir an amharc ann an Arabidopsis gu bheil làimhseachadh KAND 11 ag adhbhrachadh dì-phoilimearachadh microtubules cortical (Figear 6b). Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air an loidhne BY-2 le filamentan actin le bileagan GFP-ABD an dèidh làimhseachadh leis an aon dùmhlachd de KAND 11 agus mhothaich sinn gun do chuir làimhseachadh KAND 11 bacadh air na filamentan actin. Lùghdaich làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND 11 airson 1 uair dùmhlachd filament actin gu mòr gu 1.20 ± 0.62% no 0.61 ± 0.26%, fa leth, ach bha an dùmhlachd ann an ceallan air an làimhseachadh le DMSO 1.69 ± 0.51% (Figear 2). 7b). Tha na toraidhean seo eadar-dhealaichte bho bhuaidhean propyzamide, nach eil a’ toirt buaidh air filamentan actin, agus latrunculin B, dì-phoilimearaiche actin nach eil a’ toirt buaidh air microtubules (Figear SI S6). A bharrachd air an sin, cha do rinn làimhseachadh le coumamonamide 1, searbhag coumamonamide 6, no KAND 11 buaidh air microtubules ann an ceallan HeLa (Figear SI S7). Mar sin, thathas a’ creidsinn gu bheil meacanaig gnìomh KAND 11 eadar-dhealaichte bho fhear nan luchd-brisidh cytoskeleton aithnichte. A bharrachd air an sin, nochd ar sgrùdadh microscopach air ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 toiseach bàs cealla rè làimhseachadh KAND 11 agus sheall e nach do dh’ èirich co-roinn nan ceallan marbha le gorm Evans gu mòr an dèidh 30 mionaid de làimhseachadh KAND 11, ach an dèidh 90 mionaid de làimhseachadh le 50 μM no 100 μM KAND, dh’ èirich àireamh nan ceallan marbha gu 43.7% no 80.1%, fa leth (Figear 7c). Còmhla, tha an dàta seo a’ nochdadh gur e casg cytoskeletal sònraichte do phlannt a th’ anns an t-searbhag ursolic ùr KAND 11 le meacanaig gnìomh nach robh aithnichte roimhe.
Bidh KAND a’ toirt buaidh air microtubules cortical, filaments actin, agus beòthalachd cheallan tombaca BY-2. (a) Dealbh de microtubules cortical ann an ceallan BY-2 an làthair TagRFP-TUA6. Chaidh ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le microscopy confocal. Chaidh dùmhlachd microtubule cortical obrachadh a-mach bho mhicreagrafaichean de 25 cealla neo-eisimeileach. Tha litrichean a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean cudromach (deuchainn Tukey HSD, p< 0.05). Bàr-sgèile = 10 µm. (b) Filamentan actin cortical ann an ceallan BY-2 air an sealltainn an làthair GFP-ABD2. Chaidh ceallan BY-2 air an làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le microscopaidh confocal. Chaidh dùmhlachd filamentan actin cortical obrachadh a-mach bho mhicreagrafaichean de 25 ceallan neo-eisimeileach. Tha litrichean a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean cudromach (deuchainn Tukey HSD, p< 0.05). Bàr-sgèile = 10 µm. (c) Amharc air ceallan BY-2 marbh le bhith a’ cleachdadh dath gorm Evans. Chaidh ceallan BY-2 a chaidh a làimhseachadh le KAND 11 (50 μM no 100 μM) no DMSO a sgrùdadh le maicreasgopaidh raon-soilleir. n=3. Bàr-sgèile = 100 µm.
Tha lorg agus cleachdadh thoraidhean nàdarra ùra air leantainn gu adhartasan mòra ann an diofar thaobhan de bheatha dhaoine, a’ gabhail a-steach leigheas agus àiteachas. Chaidh rannsachadh eachdraidheil a dhèanamh gus todhar feumail fhaighinn bho ghoireasan nàdarra. Gu sònraichte, tha fios gu bheil actinomycetes feumail mar antibiotics an-aghaidh dìosganach airson nematodes air sgàth an comas diofar metabolites àrd-sgoile a thoirt gu buil leithid avermectin, am prìomh cho-thàthadh de ivermectin agus bleomycin agus na toraidhean aige, air an cleachdadh gu cungaidh-leigheis mar àidseant an-aghaidh aillse21,22. San aon dòigh, chaidh measgachadh de choimeasgaidhean luibh-mharbhtach a lorg bho actinomycetes, agus tha cuid dhiubh sin air an cleachdadh gu malairteach mu thràth1,23. Mar sin, thathas den bheachd gur e ro-innleachd èifeachdach a th’ ann an sgrùdadh metabolites actinomycete gus toraidhean nàdarra a sgaradh leis na gnìomhan bith-eòlasach a tha a dhìth. Anns an sgrùdadh seo, lorg sinn todhar ùr, coumamonamide, bho S. werraensis agus rinn sinn sintéis air gu soirbheachail. Tha searbhag ursonic na eadar-mheadhanair synthetigeach de urbenamide agus na toraidhean aige. Faodaidh e lùbadh freumhaichean àbhaisteach adhbhrachadh, gnìomhachd luibh-mharbhtach meadhanach gu làidir a nochdadh, agus cron a dhèanamh gu dìreach no gu neo-dhìreach air microtubules planntrais. Ach, is dòcha gu bheil dòigh-obrach searbhag urmotonic eadar-dhealaichte bho dhòigh-obrach luchd-bacadh microtubule a th’ ann mar-thà, leis gu bheil KAND 11 cuideachd a’ cur dragh air filamentan actin agus ag adhbhrachadh bàs cealla, a’ moladh dòigh-obrach riaghlaidh tro am bi searbhag urmotonic agus a thoradh a’ toirt buaidh air raon farsaing de structaran cytoskeletal.
Cuidichidh comharrachadh nas mionaidiche air searbhag urbenonic le bhith a’ tuigsinn meacanaig gnìomh searbhag urbenonic nas fheàrr. Gu sònraichte, is e an ath amas comas searbhag ursonach ceangal ri microtubules lùghdaichte a mheasadh gus faighinn a-mach a bheil searbhag ursonach agus a thoradh ag obair gu dìreach air microtubules agus gan dì-phoilimearachadh, no a bheil an gnìomh aca ag adhbhrachadh neo-sheasmhachd microtubule. A bharrachd air an sin, far nach eil microtubules nan targaid dhìreach, cuidichidh comharrachadh làrach gnìomh agus targaidean moileciuil searbhag ursonach air ceallan planntrais le bhith a’ tuigsinn nas fheàrr feartan choimeasgaidhean co-cheangailte agus dòighean a dh’ fhaodadh a bhith ann airson gnìomhachd luibh-mharbhadh a leasachadh. Nochd an deuchainn bith-ghnìomhachd againn comas citotocsaineach sònraichte searbhag ursonach air fàs lusan leithid Arabidopsis thaliana, tombaca agus lus an grùthan, agus cha deach buaidh a thoirt air ceallan E. coli no HeLa. Tha glè bheag de phuinnseanachadh no gun phuinnseanachadh do cheallan bheathaichean na bhuannachd do thoradh searbhag ursonach ma thèid an leasachadh mar luibh-mharbhaichean airson an cleachdadh ann an achaidhean àiteachais fosgailte. Gu dearbh, leis gu bheil microtubules nan structaran cumanta ann an eukaryotes, tha an casg roghnach ann an lusan na riatanas cudromach airson luibh-mharbhaichean. Mar eisimpleir, thathas a’ cleachdadh propyzamide, àidseant dì-phoileimearachaidh microtubule a cheanglas gu dìreach ri tubulin agus a chuireas bacadh air polymerization, mar luibh-bhiastagan air sgàth cho ìosal sa tha e puinnseanta do cheallan bheathaichean24. An coimeas ri disopyramide, tha sònrachaidhean targaid eadar-dhealaichte aig benzamides co-cheangailte. A bharrachd air microtubules planntrais, bidh RH-4032 no benzoxamide cuideachd a’ cur bacadh air microtubules cheallan bheathaichean no oomycetes, fa leth, agus thathas a’ cleachdadh zalilamide mar fhungas-fhungais air sgàth cho ìosal sa tha e puinnseanta ann am phyto25,26,27. Tha am mathan a chaidh a lorg o chionn ghoirid agus na toraidhean aige a’ nochdadh puinnseanta roghnach an aghaidh lusan, ach is fhiach a thoirt fa-near gum faodadh atharrachaidhean a bharrachd an sònrachas targaid aca atharrachadh, a dh’ fhaodadh a bhith a’ toirt seachad toraidhean a bharrachd airson smachd a chumail air fungasan pathogenic no oomycetes.
Tha feartan sònraichte searbhag urbenonic agus a thoraidhean feumail airson an leasachadh mar luibh-mharbhaichean agus an cleachdadh mar innealan rannsachaidh. Tha cudromachd an cytoskeleton ann a bhith a’ cumail smachd air cumadh cealla planntrais air aithneachadh gu farsaing. Tha sgrùdaidhean na bu thràithe air sealltainn gu bheil planntaichean air dòighean-obrach iom-fhillte de eagrachadh microtubule cortical a leasachadh le bhith a’ cumail smachd air daineamaigs microtubule gus smachd a chumail air morphogenesis gu ceart. Chaidh àireamh mhòr de mholacilean a tha an urra ri riaghladh gnìomhachd microtubule a chomharrachadh, agus tha rannsachadh co-cheangailte fhathast a’ dol air adhart3,4,28. Chan eil an tuigse a th’ againn an-dràsta air daineamaigs microtubule ann an ceallan planntrais a’ mìneachadh gu h-iomlan dòighean-obrach eagrachadh microtubule cortical. Mar eisimpleir, ged a dh’ fhaodas an dà chuid disopyramide agus oryzalin microtubules a dhì-phoilimearachadh, bidh disopyramide ag adhbhrachadh saobhadh freumha mòr agus tha buaidh caran tlàth aig oryzalin. A bharrachd air an sin, bidh mùthaidhean ann an tubulin, a bhios a’ daingneachadh microtubules, cuideachd ag adhbhrachadh dextrorotation ann am freumhaichean, ach chan eil paclitaxel, a bhios cuideachd a’ daingneachadh daineamaigs microtubule. Mar sin, bu chòir sgrùdadh agus comharrachadh nan targaidean moileciuil aig searbhag ursolic lèirsinn ùr a thoirt seachad air riaghladh microtubules cortical planntrais. San aon dòigh, bheir coimeasan san àm ri teachd eadar ceimigean a tha èifeachdach ann a bhith a’ brosnachadh fàs air a shaobhadh, leithid disopyramide, agus ceimigean nach eil cho èifeachdach, leithid oryzalin no searbhag kumamotoric, fiosrachadh dhuinn air mar a tha fàs air a shaobhadh a’ tachairt.
Air an làimh eile, tha ath-eagrachadh cytoskeletal co-cheangailte ri dìon nan cothrom eile airson mìneachadh a dhèanamh air citotoxicity searbhag ursonic. Bidh galar pathogen no toirt a-steach elicitor a-steach do cheallan planntrais uaireannan ag adhbhrachadh sgrios an cytoskeleton agus bàs cealla às deidh sin29. Mar eisimpleir, chaidh aithris gu bheil cryptoxanthin a thig bho oomycete a’ cur dragh air microtubules agus filaments actin mus bàsaich cealla tombaca, coltach ris na thachras le làimhseachadh KAND30,31. Thug na coltachdan eadar freagairtean dìon agus freagairtean cealla air an adhbhrachadh le searbhag ursonic oirnn a bhith a’ smaoineachadh gu bheil iad a’ piobrachadh phròiseasan cealla cumanta, ged a tha buaidh nas luaithe agus nas làidire aig searbhag ursonic na cryptoxanthin follaiseach. Ach, tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil briseadh filaments actin a’ brosnachadh bàs cealla gun spionnadh, nach eil an-còmhnaidh an cois briseadh microtubule29. A bharrachd air an sin, tha e fhathast ri fhaicinn an adhbharaich am pathogen no an elicitor fàs freumha air a shaobhadh, mar a bhios toraidhean searbhag ursonic a’ dèanamh. Mar sin, tha eòlas moileciuil a tha a’ ceangal freagairtean dìon agus an cytoskeleton na dhuilgheadas tarraingeach airson dèiligeadh ris. Le bhith a’ cleachdadh làthaireachd choimeasgaidhean le cuideam moileciuil ìosal co-cheangailte ri searbhag ursonach, a bharrachd air raon de dh’fhuasglaidhean le diofar chumhachdan, faodaidh iad cothroman a thoirt seachad gus targaideadh a dhèanamh air uidheaman ceallach neo-aithnichte.
Còmhla, bheir lorg agus cleachdadh choimeasgaidhean ùra a bhios ag atharrachadh daineamaigs nam microtubules dòighean cumhachdach airson dèiligeadh ris na dòighean moileciuil iom-fhillte a tha na bunait ri dearbhadh cumadh ceallan planntrais. Anns a’ cho-theacsa seo, dh’ fhaodadh an todhar a chaidh a leasachadh o chionn ghoirid le searbhag urmotonic, a bheir buaidh air microtubules agus filamentan actin agus a bhrosnaicheas bàs cealla, cothrom a thoirt dhuinn an ceangal eadar smachd microtubule agus na dòighean eile sin a dhì-chriochnachadh. Mar sin, cuidichidh mion-sgrùdadh ceimigeach agus bith-eòlasach a’ cleachdadh searbhag urbenonic sinn gus na dòighean riaghlaidh moileciuil a bhios a’ cumail smachd air cytoskeleton a’ phlannt a thuigsinn.
Cuir S. werraensis MK493-CF1 ann am flasg Erlenmeyer le baffle 500 mL anns a bheil 110 mL de mheadhan sìl anns a bheil 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) pasgan Essence, 1% (w/v) co-dhèanamh Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) earrann arbhair (KOGOSTCH Co., Ltd., Iapan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 agus 0.2% CaCO3 ann an uisge dì-ionichte. (pH 7.4 mus deach a sterilachadh). Chaidh na cultaran sìl a ghoir air criathar rothlach (180 rpm) aig 27°C airson 2 latha. Àiteachadh cinneasachaidh tro choipeadh staid chruaidh. Chaidh cultar an t-sìl (7 ml) a ghluasad gu flasg K-1 500 ml anns an robh 40 g de mheadhan cinneasachaidh air a dhèanamh suas de 15 g de eòrna brùite (MUSO Co., Ltd., Iapan) agus 25 g de dh’uisge dì-ionichte (pH gun atharrachadh mus deach a sterilachadh). Chaidh coipeadh a dhèanamh aig 30 ° C anns an dorchadas airson 14 latha. Chaidh an stuth coipeadh a thoirt a-mach le 40 ml / botal EtOH agus a chuir ann an ceud-fhulangas (1500 g, 4 ° C, 10 mionaidean). Chaidh an t-supernatant cultar (60 ml) a thoirt a-mach le measgachadh de 10% MeOH / EtOAc. Chaidh an còmhdach organach a ghalachadh fo chuideam lùghdaichte gus fuigheall (59.5 mg) fhaighinn, a chaidh a chur fo HPLC le elution caisead (0–10 mionaidean: 90%) air colbh ìre cùil (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × fad 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 mionaidean: 90% H2O/CH3CN gu 70% H2O/CH3CN (caisead), 35–45 mionaidean: 90% H2O/EtOH, 45–155 mionaidean: 90% H2O/EtOH gu 100% EtOH (caisead (caisead), 155–200 min: 100% EtOH) aig ìre sruthadh de 1.5 ml/min, chaidh coumamonamide (1, 36.0 mg) a sgaradh mar phùdar geal neo-chruthach.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ luach obraichte: 141.0659, luach tomhaiste: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Fhuaireadh sìol Columbia (Col-0) bhon Ionad Goireasan Bith-eòlasach Arabidopsis (ABRC) le cead airson a chleachdadh ann an rannsachadh. Chaidh sìol Col-0 a iomadachadh agus a chumail suas fo na cumhaichean obair-lann againn agus chaidh an cleachdadh mar lusan fiadhaich Arabidopsis. Chaidh sìol Arabidopsis a sterilachadh air an uachdar agus a chur ann am meadhan leth-neart Murashige agus Skoog anns an robh 2% siùcros (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) searbhag 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) agus 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, aig 23 °C agus solas cunbhalach. Chaidh sìol a’ mhutant phs1-1 a thoirt seachad le T. Hashimoto (Institiud Saidheans is Teicneòlais Nara).
Chaidh sìol de ghnè SR-1 a thoirt seachad le T. Hashimoto (Institiud Saidheans is Teicneòlais Nara) agus chaidh an cleachdadh mar lusan tombaca fiadhaich. Chaidh sìol tombaca a sterilachadh air an uachdar agus a bogadh ann an uisge steril airson trì oidhcheannan gus ginideachadh adhartachadh, an uairsin chaidh an cur ann am fuasgladh leth-neart anns an robh 2% siùcros, 0.05% (w/v) MES, agus 0.8% guma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. agus meadhan Skoog) le pH 5.7 agus chaidh an goir aig 23°C fo sholas cunbhalach.
Chaidh sreath Tak-1 a thoirt seachad le T. Kohchi (Oilthigh Kyoto) agus chaidh a chleachdadh mar an aonad deuchainneach àbhaisteach airson sgrùdadh cuisle an grùthan. Fhuaireadh Gemma bho lusan cultarach air an sterilachadh agus an uairsin chaidh a phlàtadh air meadhan Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) anns an robh 1% siùcros agus 0.3% guma gellan agus air a ghoir aig 23°C fo sholas leantainneach.
Chaidh ceallan tombaca BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) a thoirt seachad le S. Hasezawa (Oilthigh Tokyo). Chaidh ceallan BY-2 a lagachadh 95-fhillte ann am meadhan Linsmeier agus Skoog atharraichte agus chaidh searbhag 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 a chur ris gach seachdain. Chaidh an crochadh cealla a mheasgachadh air criathar rothlach aig 130 rpm aig 27°C anns an dorchadas. nigh na ceallan le 10 uiread an tomhas-lìonaidh de mheadhan ùr agus ath-fhuadaich san aon mheadhan. Chaidh loidhnichean cealla tar-ghineach BY-2 a bha a’ cur an cèill gu seasmhach an comharra microtubule TagRFP-TUA6 no an comharra filament actin GFP-ABD2 fon bhrosnaichear 35S bhìoras moasaig cal-flùr a chruthachadh mar a chaidh a mhìneachadh 33,34,35. Faodar na loidhnichean cealla seo a chumail suas agus a shioncronachadh a’ cleachdadh modhan-obrach coltach ris an fheadhainn a chaidh a chleachdadh airson an loidhne cealla BY-2 thùsail.
Chaidh ceallan HeLa a chur ann am meadhan Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) le 10% serum fetal bovine, 1.2 U/ml penicillin, agus 1.2 μg/ml streptomycin ann an goireadair 37°C le 5% CO2.
Chaidh a h-uile deuchainn a tha air a mhìneachadh san làmh-sgrìobhainn seo a dhèanamh a rèir riaghailtean agus stiùiridhean bith-shàbhailteachd Iapanach.
Chaidh na todhar a sgaoileadh ann an dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) mar fhuasglaidhean stoc agus an caolachadh ann am meadhan MS airson Arabidopsis agus meadhan tombaca no Gamborg B5 airson lus an grùthan. Airson an deuchainn casg fàs freumhaichean, chaidh barrachd air 10 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh na todhar ainmichte no DMSO. Chaidh na sìol a ghoir ann an seòmar fàis airson 7 latha. Chaidh dealbhan a thogail de na sìol-chraobhan agus chaidh fad nam freumhaichean a thomhas. Airson deuchainn germachaidh Arabidopsis, chaidh 48 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh 200 μM de choimeasgadh no DMSO. Chaidh sìol Arabidopsis fhàs ann an seòmar fàis agus chaidh àireamh nan sìol-chraobhan a bha a’ germachadh a chunntadh 7 latha às deidh germachadh (dag). Airson deuchainn germachadh tombaca, chaidh 24 sìol gach truinnsear a chur air meadhan agar anns an robh 200 μM KAND no DMSO. Chaidh sìol tombaca fhàs ann an seòmar fàis agus chaidh àireamh nan sìol-chraobhan a bha a’ germachadh a chunntadh às deidh 14 latha. Airson an deuchainn casg fàs cuisle an grùthan, chaidh 9 suthan bho gach plàta a chur air meadhan agar anns an robh na dùmhlachdan ainmichte de KAND no DMSO agus an uairsin gan goradh ann an seòmar fàis airson 14 latha.
Cleachd sìol-chraobhan air an dath le 5 mg/ml propidium iodide (PI) gus eagrachadh meristem freumha fhaicinn. Chaidh comharran PI fhaicinn le maicreasgopaidh fluorescence a’ cleachdadh maicreasgop sganaidh leusair confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Chaidh dathadh histocheimigeach fhreumhan le β-glucuronidase (GUS) a dhèanamh a rèir a’ phròtacal a mhìnich Malami agus Benfey36. Chaidh sìol-chraobhan a shuidheachadh ann an 90% acetone thar oidhche, an dathadh le 0.5 mg/ml searbhag 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ann am bufair GUS airson 1 uair a thìde agus an cur ann am fuasgladh chloraldehyde hydrated. (8 g chloral hydrate, 2 ml uisge agus 1 ml glycerol) agus an coimhead le microscopy eadar-dhealachaidh eadar-theachd eadar-dhealaichte a’ cleachdadh microscop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Chaidh ceàrnan freumha a thomhas air sìol-chraobhan 7 latha a dh'aois a chaidh fhàs air pleitean a chaidh a chur gu dìreach. Tomhais ceàrn na freumha bho stiùireadh a’ vectar grabhataidh mar a chaidh a mhìneachadh ann an ceum 6.
Chaidh rèiteachadh nam microtubules cortical fhaicinn mar a chaidh a mhìneachadh, le beagan atharrachaidhean air a’ phròtacal 37. Chaidh antibody anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) agus IgG anti-luchag ceangailte ri Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) a chleachdadh mar antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile aig caolachaidhean 1:1000 agus 1:100, fa leth. Chaidh ìomhaighean fluorescence fhaighinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop sganaidh laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Faigh ìomhaighean Z-stack agus cruthaich ro-mheasaidhean dian as àirde a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh.
Chaidh deuchainn iomadachadh cheallan HeLa a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh Kit Cunntaidh Cealla 8 (Dojindo) a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh.
Chaidh fàs E. coli DH5α a sgrùdadh le bhith a’ tomhas dùmhlachd cealla ann an cultar a’ cleachdadh speactrofotomeatair aig 600 nm (OD600).
Chaidh eagrachadh cytoskeletal ann an ceallan BY-2 tar-ghinteil fhaicinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop fluorescence uidheamaichte le inneal sganaidh confocal CSU-X1 (Yokogawa) agus camara sCMOS (Zyla, Andor Technology). Chaidh dùmhlachd cytoskeletal a mheasadh le mion-sgrùdadh ìomhaighean, a thomhais ceudad piogsail cytoskeletal am measg piogsail cytoplasmach ann an ìomhaighean confocal a’ cleachdadh bathar-bog ImageJ mar a chaidh a mhìneachadh38,39.
Gus bàs cealla a lorg ann an ceallan BY-2, chaidh cuibhreann den fhuasgladh cealla a ghoir le 0.05% gorm Evans airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair. Tha dathadh gorm Evans roghnach de cheallan marbh an urra ri toirt a-mach an dath bho cheallan beòthail leis a’ membran plasma slàn40. Chaidh ceallan dathte fhaicinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop raon-soilleir (BX53, Olympus).
Chaidh ceallan HeLa fhàs ann an DMEM le 10% FBS ann an goireadair tais aig 37°C agus 5% CO2. Chaidh na ceallan a làimhseachadh le 100 μM KAND 11, searbhag kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), no 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) airson 6 uairean a thìde aig 37°C. Chaidh na ceallan a shocrachadh le MetOH airson 10 mionaidean agus an uairsin le acetate airson 5 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh na ceallan socaichte a ghoir le antibody bun-sgoile β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) air a lagachadh ann an 0.5% BSA/PBS airson 2 uair a thìde, an nighe 3 tursan le TBST, agus an uairsin an goir le antibody gobhair Alexa Fluor. 488 1 uair a thìde. – IgG luchaige (Thermo Fisher Scientific: A11001) agus 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) air a lagachadh ann an 0.5% BSA/PBS. Às dèidh a nighe le TBST trì tursan, chaidh ceallan dathte fhaicinn air miocroscop inbhirteach Nikon Eclipse Ti-E. Chaidh ìomhaighean a ghlacadh le camara CCD fuarach Hamamatsu ORCA-R2 a’ cleachdadh bathar-bog MetaMorph (Molecular Devices).
Àm puist: Ògmhios-17-2024