Tha fàs meristem apical nan geugan (SAM) deatamach airson ailtireachd nan gasan. Hormonaichean planntraisgibberellinsTha (GAn) a’ cluich prìomh dhleastanasan ann a bhith a’ co-òrdanachadh fàs lusan, ach chan eil an dreuchd aca anns an SAM air a thuigsinn gu math fhathast. An seo, leasaich sinn biosensor ratiometric de chomharran GA le bhith ag innleadaireachd am pròtain DELLA gus a dhleastanas riaghlaidh riatanach a chumail fodha ann am freagairt tar-sgrìobhaidh GA agus aig an aon àm a’ gleidheadh a lobhadh nuair a thèid GA aithneachadh. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil am biosensor stèidhichte air lobhadh seo a’ clàradh atharrachaidhean ann an ìrean GA agus mothachadh ceallach rè leasachadh gu ceart. Chleachd sinn am biosensor seo gus gnìomhachd chomharran GA anns an SAM a mhapadh. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil comharran GA àrd an làthair sa mhòr-chuid ann an ceallan a tha suidhichte eadar primordia organ, a tha nan ro-ruithearan do cheallan internode. A’ cleachdadh dhòighean-obrach buannachd-agus-call-gnìomh, tha sinn a’ sealltainn cuideachd gu bheil GA a’ riaghladh treòrachadh plèana roinneadh cealla, a’ stèidheachadh eagrachadh ceallach canònach internodes, agus mar sin a’ brosnachadh sònrachadh internode anns an SAM.
Tha am meristem apical broilleach (SAM), a tha suidhichte aig mullach a’ bhroilleich, a’ toirt a-steach àite sònraichte de cheallan gas a bhios a’ gineadh buill-bodhaig taobhach agus nodan gas ann an dòigh mhodúlach agus ath-aithriseach fad beatha a’ phlannt. Tha gach aon de na h-aonadan ath-aithriseach seo, no nodan planntrais, a’ toirt a-steach internodan agus buill-bodhaig taobhach aig na nodan, agus meristems axillary ann an axils nan duilleagan1. Bidh fàs agus eagrachadh nodan planntrais ag atharrachadh rè leasachadh. Ann an Arabidopsis, tha fàs internodal air a chumail fodha rè na h-ìre fàsmhorachd, agus bidh meristems axillary a’ fuireach neo-ghnìomhach ann an axils dhuilleagan rosette. Rè an atharrachaidh chun ìre flùrach, bidh an SAM na meristem inflorescence, a’ gineadh internodan fada agus gucagan axillary, geugan beaga ann an axils dhuilleagan cauline, agus nas fhaide air adhart, flùraichean gun duilleag2. Ged a tha sinn air adhartas mòr a dhèanamh ann a bhith a’ tuigsinn nan dòighean a bhios a’ cumail smachd air tòiseachadh dhuilleagan, fhlùraichean agus gheugan, chan eil mòran fiosrachaidh againn mu mar a bhios internodan ag èirigh.
Cuidichidh tuigse air sgaoileadh spatiotemporal GAn le bhith a’ tuigsinn gnìomhan nan hormonaichean seo ann an diofar fhigheagan agus aig diofar ìrean leasachaidh. Tha lèirsinn air crìonadh an aonaidh RGA-GFP a tha air a chur an cèill fo ghnìomh a bhrosnaichear fhèin a’ toirt seachad fiosrachadh cudromach mu riaghladh ìrean iomlan GA ann am freumhaichean15,16. Ach, tha abairt RGA ag atharrachadh thar fhigheagan17 agus tha e air a riaghladh le GA18. Mar sin, faodaidh abairt eadar-dhealaichte brosnaichear RGA leantainn gu pàtran fluorescent a chithear le RGA-GFP agus mar sin chan eil an dòigh seo cainneachdail. O chionn ghoirid, nochd GA le bileag fluorescein (Fl) bith-ghnìomhach19,20 cruinneachadh GA ann an endocortex na freumha agus riaghladh nan ìrean cealla aige le còmhdhail GA. O chionn ghoirid, sheall an sensor GA FRET nlsGPS1 gu bheil ìrean GA co-cheangailte ri leudachadh cealla ann am freumhaichean, filamentan, agus hypocotyls dorcha21. Ach, mar a chunnaic sinn, chan e dùmhlachd GA an aon pharamadair a tha a’ cumail smachd air gnìomhachd comharran GA, oir tha e an urra ri pròiseasan mothachaidh iom-fhillte. An seo, a’ togail air ar tuigse air slighean comharran DELLA agus GA, tha sinn ag aithris leasachadh agus comharrachadh biosensor ratiometric stèidhichte air crìonadh airson comharran GA. Gus am biosensor cainneachdail seo a leasachadh, chleachd sinn RGA mutant mothachail air GA a chaidh a cheangal ri pròtain fluorescent agus air a chuir an cèill gu h-uile-làthaireach ann an clòthan, a bharrachd air pròtain fluorescent neo-mhothachail air GA. Tha sinn a’ sealltainn nach eil na co-thàthaidhean pròtain RGA mutant a’ cur bacadh air comharran GA endogenous nuair a thèid an cur an cèill gu h-uile-làthaireach, agus gum faod am biosensor seo gnìomhachd comharran a thomhas a thig bho chuir-a-steach GA agus giullachd comharran GA leis an inneal mothachaidh le rùn àrd spatiotemporal. Chleachd sinn am biosensor seo gus mapadh a dhèanamh air sgaoileadh spatiotemporal gnìomhachd comharran GA agus gus thomhas a dhèanamh air mar a bhios GA a’ riaghladh giùlan ceallach ann an epidermis SAM. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil GA a’ riaghladh treòrachadh plèana roinneadh cheallan SAM a tha suidhichte eadar primordia organ, agus mar sin a’ mìneachadh eagrachadh ceallach canònach an internode.
Mu dheireadh, dh’fhaighnich sinn an gabhadh le qmRGA atharrachaidhean ann an ìrean GA dùthchasach aithris le bhith a’ cleachdadh hypocotyls a bha a’ fàs. Sheall sinn roimhe seo gu bheil nitrate a’ brosnachadh fàs le bhith ag àrdachadh co-chur GA agus, mar thoradh air sin, lobhadh DELLA34. A rèir sin, mhothaich sinn gu robh fad an hypocotyl ann an sìol-chraobhan pUBQ10::qmRGA a chaidh fhàs fo sholar pailt nitrate (10 mM NO3−) gu math nas fhaide na bha e ann an sìol-chraobhan a chaidh fhàs fo chumhachan easbhaidh nitrate (Figear a bharrachd 6a). A rèir freagairt an fhàs, bha comharran GA nas àirde ann an hypocotyls sìol-chraobhan a chaidh fhàs fo chumhachan 10 mM NO3− na ann an sìol-chraobhan a chaidh fhàs às aonais nitrate (Figear a bharrachd 6b, c). Mar sin, leigidh qmRGA cuideachd le bhith a’ cumail sùil air atharrachaidhean ann an comharran GA air an adhbhrachadh le atharrachaidhean dùthchasach ann an dùmhlachd GA.
Gus tuigse fhaighinn air a bheil gnìomhachd chomharran GA a lorgar le qmRGA an urra ri dùmhlachd GA agus mothachadh GA, mar a bha dùil stèidhichte air dealbhadh an sensor, rinn sinn mion-sgrùdadh air abairt nan trì gabhadairean GID1 ann an clòthan fàsmhor is gintinn. Ann an sìol-chraobhan, sheall an loidhne aithris GID1-GUS gu robh GID1a agus c air an cur an cèill gu mòr ann an cotyledons (Figear 3a–c). A bharrachd air an sin, chaidh na trì gabhadairean uile a chur an cèill ann an duilleagan, primordia freumha taobhach, bàrr freumha (ach a-mhàin caip freumha GID1b), agus an siostam vascular (Figear 3a–c). Anns an SAM inflorescence, lorg sinn comharran GUS airson GID1b agus 1c a-mhàin (Figear a bharrachd 7a–c). Dhearbh hibridachadh in situ na pàtrain abairt seo agus sheall e tuilleadh gu robh GID1c air a chur an cèill gu cothromach aig ìrean ìosal anns an SAM, ach sheall GID1b abairt nas àirde aig iomall an SAM (Figear a bharrachd 7d–l). Nochd an co-thàthadh eadar-theangachaidh pGID1b::2xmTQ2-GID1b raon ìreichte de dh’abairt GID1b cuideachd, bho abair ìre ìosal no gun abair ìre ann am meadhan an SAM gu abair ìre àrd aig crìochan nan organan (Figear a bharrachd 7m). Mar sin, chan eil gabhadairean GID1 air an sgaoileadh gu cothromach thar agus taobh a-staigh fhigheagan. Ann an deuchainnean às dèidh sin, mhothaich sinn cuideachd gun do mheudaich cus-abairt GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) cugallachd qmRGA ann an hypocotyls ri cur an sàs GA taobh a-muigh (Figear 3d, e). An coimeas ri sin, bha fluorescence a chaidh a thomhas le qd17mRGA anns an hypocotyl neo-mhothachail do làimhseachadh GA3 (Figear 3f, g). Airson an dà dheuchainn, chaidh sìol-chraobhan a làimhseachadh le dùmhlachdan àrda de GA (100 μM GA3) gus measadh a dhèanamh air giùlan luath an sensor, far an deach an comas ceangal ris an gabhadair GID1 a neartachadh no a chall. Còmhla, tha na toraidhean seo a’ dearbhadh gu bheil am biosensor qmRGA a’ frithealadh gnìomh còmhla mar GA agus sensor GA, agus a’ moladh gum faod eadar-dhealachadh ann an abairteachadh an gabhadair GID1 sgaoileadh an sensor atharrachadh gu mòr.
Gus an-diugh, chan eil sgaoileadh chomharran GA anns an SAM soilleir fhathast. Mar sin, chleachd sinn lusan a tha a’ cur an cèill qmRGA agus an neach-aithris cealla gas pCLV3::mCherry-NLS35 gus mapaichean cainneachdail àrd-rèiteachaidh de ghnìomhachd chomharran GA obrachadh a-mach, le fòcas air an t-sreath L1 (epidermis; Figear 4a, b, faic Modhan agus Modhan a bharrachd), leis gu bheil pàirt chudromach aig L1 ann a bhith a’ cumail smachd air fàs SAM36. An seo, thug abairt pCLV3::mCherry-NLS puing iomraidh geoimeatrach stèidhichte airson mion-sgrùdadh a dhèanamh air sgaoileadh spàsail is sealach gnìomhachd chomharran GA37. Ged a thathas den bheachd gu bheil GA riatanach airson leasachadh organ taobhach4, mhothaich sinn gu robh comharran GA ìosal anns a’ phrìomh-fhlùraichean (P) a’ tòiseachadh bhon ìre P3 (Figear 4a, b), ach bha gnìomhachd meadhanach aig prìomh-fhlùraichean òga P1 agus P2 coltach ris an fhear anns an roinn mheadhanach (Figear 4a, b). Chaidh gnìomhachd chomharran GA nas àirde a lorg aig crìochan primordium an organ, a’ tòiseachadh aig P1/P2 (air taobhan na crìche) agus a’ ruighinn àirde aig P4, a bharrachd air anns a h-uile cealla den roinn iomaill a tha suidhichte eadar na primordia (Figear 4a, b agus Figear a bharrachd 8a, b). Chaidh an gnìomhachd chomharran GA nas àirde seo fhaicinn chan ann a-mhàin san epidermis ach cuideachd anns na sreathan L2 agus L3 àrd (Figear a bharrachd 8b). Dh’fhan pàtran nan comharran GA a chaidh a lorg anns an SAM a’ cleachdadh qmRGA gun atharrachadh thar ùine (Figear a bharrachd 8c–f, k). Ged a chaidh an togail qd17mRGA a lughdachadh gu siostamach ann an SAM de lusan T3 bho chòig loidhnichean neo-eisimeileach a chomharraich sinn gu mionaideach, bha sinn comasach air na pàtrain fluorescence a fhuaireadh leis an togail pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP a sgrùdadh (Figear a bharrachd 8g–j, l). Anns an loidhne smachd seo, cha deach ach atharrachaidhean beaga anns a’ cho-mheas fluorescence a lorg anns an SAM, ach ann an ionad SAM chunnaic sinn lùghdachadh soilleir agus ris nach robh dùil ann an VENUS co-cheangailte ri TagBFP. Tha seo a’ dearbhadh gu bheil am pàtran comharran a chithear le qmRGA a’ nochdadh crìonadh mRGA-VENUS a tha an urra ri GA, ach tha e cuideachd a’ sealltainn gum faodadh qmRGA cus a dhèanamh de ghnìomhachd comharran GA ann am meadhan a’ meristem. Mar gheàrr-chunntas, tha na toraidhean againn a’ nochdadh pàtran comharran GA a tha sa mhòr-chuid a’ nochdadh sgaoileadh nam primordia. Tha an sgaoileadh seo den roinn eadar-phrìomhadail (IPR) mar thoradh air stèidheachadh mean air mhean de ghnìomhachd comharran GA àrd eadar am primordium a tha a’ leasachadh agus an roinn mheadhanach, agus aig an aon àm tha gnìomhachd comharran GA anns a’ phrìomhadium a’ lùghdachadh (Figear 4c, d).
Tha sgaoileadh gabhadairean GID1b agus GID1c (faic gu h-àrd) a’ moladh gu bheil diofar abairtean gabhadairean GA a’ cuideachadh le bhith a’ cumadh pàtran gnìomhachd chomharran GA anns an SAM. Bha sinn a’ faighneachd an robh cruinneachadh eadar-dhealaichte de GA an sàs. Gus sgrùdadh a dhèanamh air a’ chomas seo, chleachd sinn an sensor nlsGPS1 GA FRET21. Chaidh tricead gnìomhachaidh nas àirde a lorg ann an SAM de nlsGPS1 air a làimhseachadh le 10 μM GA4+7 airson 100 mionaid (Figear a bharrachd 9a–e), a’ nochdadh gu bheil nlsGPS1 a’ freagairt ri atharrachaidhean ann an dùmhlachd GA anns an SAM, mar a tha e a’ dèanamh ann am freumhaichean21. Nochd sgaoileadh spàsail tricead gnìomhachaidh nlsGPS1 ìrean GA an ìre mhath ìosal anns na sreathan a-muigh den SAM, ach sheall e gu robh iad air an àrdachadh ann am meadhan agus aig crìochan an SAM (Figear 4e agus Figear a bharrachd 9a,c). Tha seo a’ moladh gu bheil GA cuideachd air a sgaoileadh anns an SAM le pàtran spàsail a tha co-chosmhail ris an fhear a nochd qmRGA. Mar dhòigh-obrach co-phàirteach, làimhsich sinn an SAM le GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) no Fl leis fhèin mar smachd àicheil. Chaidh an comharra Fl a sgaoileadh air feadh an SAM, a’ gabhail a-steach an roinn mheadhanach agus am primordium, ged a bha e aig dian nas ìsle (Figear 4j agus Figear a bharrachd 10d). An coimeas ri sin, chruinnich an trì GA-Fl gu sònraichte taobh a-staigh crìochan a’ primordium agus gu diofar ìrean anns a’ chòrr den IPR, le GA7-Fl a’ cruinneachadh anns an raon as motha san IPR (Figear 4k agus Figear a bharrachd 10a,b). Nochd tomhas dian fluorescence gu robh an co-mheas dian IPR gu neo-IPR nas àirde ann an SAM air a làimhseachadh le GA-Fl an taca ri SAM air a làimhseachadh le Fl (Figear 4l agus Figear a bharrachd 10c). Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh gu bheil GA an làthair aig dùmhlachdan nas àirde ann an ceallan IPR a tha suidhichte as fhaisge air crìoch an organ. Tha seo a’ moladh gu bheil pàtran gnìomhachd comharran SAM GA mar thoradh air an dà chuid diofar abairtean gabhadan GA agus cruinneachadh eadar-dhealaichte de GA ann an ceallan IPR faisg air crìochan organ. Mar sin, nochd an anailis againn pàtran spatiotemporal ris nach robh dùil de chomharran GA, le gnìomhachd nas ìsle ann am meadhan agus primordium an SAM agus gnìomhachd nas àirde anns an IPR anns an roinn imeallach.
Gus tuigse fhaighinn air àite gnìomhachd chomharran GA eadar-dhealaichte anns an SAM, rinn sinn mion-sgrùdadh air a’ cheangal eadar gnìomhachd chomharran GA, leudachadh cealla, agus roinneadh cealla a’ cleachdadh ìomhaighean fìor-ùine den SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Leis a’ phàirt a th’ aig GA ann an riaghladh fàis, bha dùil ri ceangal adhartach le paramadairean leudachadh cealla. Mar sin, rinn sinn coimeas an toiseach eadar mapaichean gnìomhachd chomharran GA agus mapaichean de ìre fàis uachdar cealla (mar neach-ionaid airson neart leudachadh cealla airson cealla sònraichte agus airson ceallan nighean aig roinneadh) agus le mapaichean de anisotropy fàis, a bhios a’ tomhas stiùireadh leudachadh cealla (air a chleachdadh an seo cuideachd airson cealla sònraichte agus airson ceallan nighean aig roinneadh; Figear 5a,b, faic Modhan agus Modhan a bharrachd). Tha na mapaichean againn de ìre fàis uachdar cealla SAM a rèir beachdan roimhe38,39, le ìrean fàis as ìsle aig a’ chrìch agus ìrean fàis as àirde ann am flùraichean a tha a’ leasachadh (Figear 5a). Sheall mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) gu robh gnìomhachd chomharran GA co-cheangailte gu àicheil ri dian fàis uachdar cealla (Figear 5c). Sheall sinn cuideachd gu robh na prìomh aisean atharrachaidh, a’ gabhail a-steach cuir a-steach comharran GA agus dian fàis, ceart-cheàrnach ris an t-slighe a chaidh a dhearbhadh le abairt àrd CLV3, a’ dearbhadh gun deach ceallan a dhùnadh a-mach à ionad SAM anns na mion-sgrùdaidhean a bha air fhàgail. Dhearbh mion-sgrùdadh co-dhàimh Spearman na toraidhean PCA (Figear 5d), a’ nochdadh nach robh comharran GA nas àirde san IPR ag adhbhrachadh leudachadh cealla nas àirde. Ach, nochd mion-sgrùdadh co-dhàimh beagan co-dhàimh adhartach eadar gnìomhachd comharran GA agus anisotropy fàis (Figear 5c, d), a’ moladh gu bheil comharran GA nas àirde san IPR a’ toirt buaidh air stiùireadh fàs cealla agus is dòcha suidheachadh plèana roinneadh cealla.
a, b Mapaichean teas de fhàs uachdar cuibheasach (a) agus anisotropy fàis (b) ann an SAM air an cuibheasachadh thairis air seachd lusan neo-eisimeileach (air an cleachdadh mar riochdairean airson neart agus stiùireadh leudachadh cealla, fa leth). c Bha na caochladairean a leanas ann an mion-sgrùdadh PCA: comharra GA, dian fàis uachdar, anisotropy fàis uachdar, agus abairt CLV3. Bha co-cheangal àicheil sa mhòr-chuid aig co-phàirt PCA 1 ri dian fàis uachdar agus co-cheangailte gu dearbhach ri comharra GA. Bha co-phàirt PCA 2 sa mhòr-chuid co-cheangailte gu dearbhach ri anisotropy fàis uachdar agus co-cheangailte gu àicheil ri abairt CLV3. Tha ceudadan a’ riochdachadh an atharrachaidh a mhìnicheas gach co-phàirt. d Mion-sgrùdadh co-dhàimh Spearman eadar comharra GA, dian fàis uachdar, agus anisotropy fàis uachdar aig sgèile clò às aonais CZ. Is e an àireamh air an làimh dheis luach rho Spearman eadar dà chaochladair. Tha reultan a’ comharrachadh chùisean far a bheil an co-dhàimh/co-dhàimh àicheil gu math cudromach. e Lèirsinn 3D de cheallan Col-0 SAM L1 le microscopy confocal. Tha ballachan cealla ùra a chaidh a chruthachadh anns an SAM (ach chan e am primordium) aig 10 uairean a thìde air an dath a rèir an luachan ceàrn. Tha am bàr dathte air a shealltainn anns an oisean gu h-ìosal air an làimh dheis. Tha an cuir-a-steach a’ sealltainn an ìomhaigh 3D co-fhreagarrach aig 0 uair. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean coltach ris. f Tha plotaichean bogsa a’ taisbeanadh ìrean roinneadh cealla ann an SAM IPR agus neo-IPR Col-0 (n = 10 lusan neo-eisimeileach). Tha an loidhne mheadhain a’ sealltainn a’ mheadhain, agus tha crìochan a’ bhogsa a’ comharrachadh an 25mh agus an 75mh ceudadan. Tha na feusagan a’ comharrachadh nan luachan as ìsle agus as àirde a chaidh a dhearbhadh le bathar-bog R. Fhuaireadh luachan P le deuchainn-t dà-earballach Welch. g, h Diagram sgemataigeach a’ sealltainn (g) mar a thomhaiseas tu ceàrn balla na cealla ùire (magenta) a thaobh an stiùiridh rèididheach bho mheadhan an SAM (loidhne dhotagach geal) (chan eil ach luachan ceàrn biorach, ie, 0–90°, air am beachdachadh), agus (h) na stiùiridhean cuairteachaidh/taobhach agus rèididheach taobh a-staigh a’ meristem. i Histograman tricead de stiùireadh plèana roinneadh cealla thar an SAM (gorm dorcha), IPR (gorm meadhanach), agus neo-IPR (gorm aotrom), fa leth. Fhuaireadh luachan P le deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earballach. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean coltach ris. j Histograman tricead de stiùireadh plèana roinneadh cealla an IPR timcheall air P3 (uaine aotrom), P4 (uaine meadhanach), agus P5 (uaine dorcha), fa leth. Fhuaireadh luachan P le deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earballach. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean coltach ris.
Mar sin, rinn sinn sgrùdadh an ath rud air a’ cheangal eadar comharradh GA agus gnìomhachd roinneadh cealla le bhith a’ comharrachadh ballachan cealla a chaidh a chruthachadh às ùr rè an deuchainn (Figear 5e). Leig an dòigh-obrach seo leinn tricead agus stiùireadh roinneadh cealla a thomhas. Gu h-iongantach, fhuair sinn a-mach gu robh tricead roinnean cealla anns an IPR agus a’ chòrr den SAM (neo-IPR, Figear 5f) coltach ri chèile, a’ nochdadh nach eil eadar-dhealachaidhean ann an comharradh GA eadar ceallan IPR agus neo-IPR a’ toirt buaidh mhòr air roinneadh cealla. Thug seo, agus an ceangal adhartach eadar comharradh GA agus anisotropy fàis, oirnn beachdachadh air an gabhadh buaidh a thoirt air gnìomhachd comharradh GA air treòrachadh plèana roinneadh cealla. Thomhais sinn treòrachadh balla na cealla ùire mar cheàrn biorach an coimeas ris an axis radial a tha a’ ceangal meadhan a’ meristem agus meadhan balla na cealla ùire (Figear 5e-i) agus mhothaich sinn claonadh soilleir do cheallan roinn aig ceàrnan faisg air 90° an coimeas ris an axis radial, leis na triceadan as àirde air am faicinn aig 70–80° (23.28%) agus 80–90° (22.62%) (Figear 5e,i), a tha a’ freagairt ri roinnean cealla san t-slighe cuairteach/transverse (Figear 5h). Gus sgrùdadh a dhèanamh air tabhartas chomharran GA don ghiùlan roinneadh cealla seo, rinn sinn mion-sgrùdadh air paramadairean roinneadh cealla anns an IPR agus neo-IPR air leth (Figear 5i). Chunnaic sinn gu robh an sgaoileadh ceàrn roinneadh ann an ceallan IPR eadar-dhealaichte bhon fhear ann an ceallan neo-IPR no ann an ceallan anns an SAM gu lèir, le ceallan IPR a’ taisbeanadh co-roinn nas àirde de roinnean cealla taobhach/cruinn, i.e., 70–80° agus 80–90° (33.86% agus 30.71%, fa leth, co-roinnean co-fhreagarrach) (Figear 5i). Mar sin, nochd na beachdan againn ceangal eadar comharradh GA àrd agus treòrachadh plèana roinneadh cealla faisg air an treòrachadh cuairteachaidh, coltach ris a’ cho-dhàimh eadar gnìomhachd comharran GA agus anisotropy fàis (Figear 5c, d). Gus tuilleadh a stèidheachadh air glèidhteachas fànais a’ cheangail seo, thomhais sinn treòrachadh plèana an roinneadh ann an ceallan IPR timcheall air a’ phrìomh-bhaile a’ tòiseachadh bho P3, leis gun deach an gnìomhachd comharran GA as àirde a lorg san roinn seo a’ tòiseachadh bho P4 (Figear 4). Cha do sheall ceàrnan roinneadh an IPR timcheall air P3 agus P4 eadar-dhealachaidhean cudromach gu staitistigeil, ged a chaidh tricead nas àirde de roinnean cealla taobhach fhaicinn anns an IPR timcheall air P4 (Figear 5j). Ach, anns na ceallan IPR timcheall air P5, dh’fhàs an diofar ann an treòrachadh plèana roinneadh cealla cudromach gu staitistigeil, le àrdachadh geur ann an tricead roinnean cealla transverse (Figear 5j). Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh gum faod comharradh GA smachd a chumail air treòrachadh roinnean cealla anns an SAM, a tha a’ co-chòrdadh ri aithisgean roimhe40,41 gum faod comharradh GA àrd treòrachadh taobhach roinnean cealla a bhrosnachadh anns an IPR.
Thathar a’ ro-innse nach tèid ceallan san IPR a thoirt a-steach do na primordia ach an àite sin do na h-internodes2,42,43. Dh’ fhaodadh gum bi an treòrachadh transverse de roinnean cealla san IPR ag adhbhrachadh an eagrachaidh àbhaisteach de shreathan fada-fhaid co-shìnte de cheallan epidermal ann an internodes. Tha na beachdan againn a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd a’ moladh gu bheil comharradh GA dualtach pàirt a ghabhail sa phròiseas seo le bhith a’ riaghladh stiùireadh roinneadh cealla.
Bidh call gnìomh grunn ghinean DELLA ag adhbhrachadh freagairt GA bun-reachdail, agus faodar mutantan della a chleachdadh gus an teòiridh seo a dhearbhadh44. An toiseach, rinn sinn mion-sgrùdadh air pàtrain abairt còig ginean DELLA anns an SAM. Nochd co-thàthadh tar-sgrìobhaidh loidhne GUS45 gun deach GAI, RGA, RGL1, agus RGL2 (gu ìre mòran nas lugha) a chur an cèill anns an SAM (Figear a bharrachd 11a–d). Sheall hibridachadh in situ cuideachd gu bheil mRNA GAI a’ cruinneachadh gu sònraichte ann am primordia agus flùraichean a tha a’ leasachadh (Figear a bharrachd 11e). Chaidh mRNA RGL1 agus RGL3 a lorg air feadh canopy SAM agus ann am flùraichean nas sine, ach bha mRNA RGL2 nas pailte anns an roinn crìche (Figear a bharrachd 11f–h). Dhearbh ìomhaighean confocal de pRGL3::RGL3-GFP SAM an abairt a chaidh fhaicinn le hibridachadh in situ agus sheall iad gu bheil pròtain RGL3 a’ cruinneachadh ann am meadhan an SAM (Figear a bharrachd 11i). A’ cleachdadh na loidhne pRGA::GFP-RGA, fhuair sinn a-mach cuideachd gu bheil pròtain RGA a’ cruinneachadh anns an SAM, ach tha a pailteas a’ lùghdachadh aig a’ chrìoch a’ tòiseachadh bho P4 (Figear a bharrachd 11j). Gu sònraichte, tha pàtrain abairteachaidh RGL3 agus RGA a rèir gnìomhachd chomharran GA nas àirde anns an IPR, mar a chaidh a lorg le qmRGA (Figear 4). A bharrachd air an sin, tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil a h-uile DELLA air an cur an cèill anns an SAM agus gu bheil an abairt aca còmhla a’ dol thairis air an SAM gu lèir.
An ath rud, rinn sinn mion-sgrùdadh air paramadairean roinneadh cealla anns an SAM fiadhaich (Ler, smachd) agus na mutantan còig-cheàrnach (cruinneil) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Figear 6a, b). Gu inntinneach, chunnaic sinn gluasad cudromach gu staitistigeil ann an sgaoileadh tricead ceàrn roinneadh cealla anns an SAM mutant della global an taca ris an t-seòrsa fiadhaich (Figear 6c). Bha an t-atharrachadh seo anns a’ mutant della global mar thoradh air àrdachadh ann an tricead cheàrnan 80–90° (34.71% an aghaidh 24.55%) agus, gu ìre nas lugha, ceàrnan 70–80° (23.78% an aghaidh 20.18%), i.e., a tha a’ freagairt ri roinnean cealla transverse (Figear 6c). Bha tricead roinnean neo-transverse (0–60°) nas ìsle cuideachd anns a’ mutant della global (Figear 6c). Bha tricead roinnean cealla transverse air a mheudachadh gu mòr ann an SAM a’ mutant della global (Figear 6b). Bha tricead roinnean cealla transverse san IPR nas àirde cuideachd anns a’ mutant della global an taca ris an t-seòrsa fiadhaich (Figear 6d). Taobh a-muigh roinn IPR, bha sgaoileadh nas cunbhalaiche de cheàrnan roinneadh cealla aig an t-seòrsa fiadhaich, ach b’ fheàrr leis a’ mutant della global roinnean tangential mar an IPR (Figear 6e). Rinn sinn tomhas cuideachd air treòrachadh roinnean cealla ann an SAM de mutantan còig-fhillte ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, agus ga2ox6-2), cùl-raon mutant neo-ghnìomhach GA anns a bheil GA a’ cruinneachadh. A rèir an àrdachadh ann an ìrean GA, bha SAM an inflorescence mutant còig-fhillte ga2ox nas motha na Col-0 (Figear a bharrachd 12a, b), agus an taca ri Col-0, sheall an SAM còig-fhillte ga2ox sgaoileadh gu math eadar-dhealaichte de cheàrnan roinneadh cealla, leis an tricead ceàrn ag àrdachadh bho 50° gu 90°, ie a-rithist a’ fàbharachadh roinnean tangential (Figear a bharrachd 12a–c). Mar sin, tha sinn a’ sealltainn gu bheil gnìomhachadh bun-reachdail de chomharran GA agus cruinneachadh GA ag adhbhrachadh roinnean cealla taobhach anns an IPR agus a’ chòrr den SAM.
a, b Lèirsinn 3D den shreath L1 de SAM Ler air a dhath le PI (a) agus mutant della cruinneil (b) a’ cleachdadh maicreasgopaidh confocal. Tha ballachan cealla ùra a chaidh a chruthachadh anns an SAM (ach chan e am primordium) thar ùine 10 uairean a thìde air an sealltainn agus air an dath a rèir an luachan ceàrn. Tha an cuir-a-steach a’ sealltainn an SAM aig 0 uairean a thìde. Tha am bàr dath air a thaisbeanadh anns an oisean gu h-ìosal air an làimh dheis. Tha an t-saighead ann an (b) a’ comharrachadh eisimpleir de fhaidhlichean cealla co-thaobhach anns a’ mutant della cruinneil. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean coltach ris. coimeas ce de sgaoileadh tricead stiùiridhean plèana roinneadh cealla anns an SAM gu lèir (d), IPR (e), agus neo-IPR (f) eadar Ler agus della cruinneil. Fhuaireadh luachan P a’ cleachdadh deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earballach. f, g Lèirsinn 3D de dhealbhan confocal de SAM air a dhath le PI de lusan tar-ghinealach Col-0 (i) agus pCUC2::gai-1-VENUS (j). Tha pannalan (a, b) a’ sealltainn ballachan cealla ùra (ach chan e primordia) a chaidh a chruthachadh anns an SAM taobh a-staigh 10 uairean a thìde. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean coltach ris. h–j Coimeas eadar sgaoileadh tricead stiùiridhean plèana roinneadh cealla a tha suidhichte anns an SAM gu lèir (h), IPR (i) agus neo-IPR (j) eadar lusan Col-0 agus pCUC2::gai-1-VENUS. Fhuaireadh luachan P a’ cleachdadh deuchainn dà-earballach Kolmogorov–Smirnov.
An ath rud, rinn sinn deuchainn air buaidh casg a chur air comharran GA gu sònraichte anns an IPR. Gus seo a dhèanamh, chleachd sinn am brosnaichear cotyledon cup 2 (CUC2) gus abairt pròtain gai-1 àicheil ceannasach a bhrosnachadh a tha ceangailte ri VENUS (anns an loidhne pCUC2::gai-1-VENUS). Anns an SAM fiadhaich, bidh am brosnaichear CUC2 a’ stiùireadh abairt a’ mhòr-chuid de IPRan anns an SAM, a’ gabhail a-steach ceallan crìche, bho P4 air adhart, agus chaidh abairt shònraichte coltach ris fhaicinn ann an lusan pCUC2::gai-1-VENUS (faic gu h-ìosal). Cha robh sgaoileadh cheàrnan roinneadh cealla thar SAM no IPR lusan pCUC2::gai-1-VENUS gu math eadar-dhealaichte bhon t-seòrsa fiadhaich, ged a fhuair sinn a-mach, gun dùil, gun robh ceallan às aonais IPR anns na lusan sin a’ roinn aig tricead nas àirde de 80–90° (Figear 6f–j).
Chaidh a mholadh gu bheil stiùireadh roinneadh cealla an urra ri geoimeatraidh an SAM, gu sònraichte an cuideam tensile a chruthaicheas lùbadh an fhigheagan46. Mar sin dh’fhaighnich sinn an robh cumadh an SAM air atharrachadh anns na lusan mutant della global agus pCUC2::gai-1-VENUS. Mar a chaidh aithris roimhe12, bha meud an SAM mutant della global nas motha na meud an t-seòrsa fiadhaich (Figear a bharrachd 13a, b, d). Dhearbh hibridachadh in situ de CLV3 agus RNA STM leudachadh meristem ann am mutants della agus sheall e cuideachd leudachadh taobhach àite cealla gas (Figear a bharrachd 13e, f, h, i). Ach, bha lùbadh an SAM coltach anns an dà sheòrsa (Figear a bharrachd 13k, m, n, p). Chunnaic sinn àrdachadh coltach ri meud anns a’ mutant ceithir-cheàrnach gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della gun atharrachadh ann an lùbadh an taca ris an t-seòrsa fiadhaich (Figear a bharrachd 13c, d, g, j, l, o, p). Bha buaidh aig tricead treòrachadh roinneadh cealla cuideachd anns a’ mutant ceithir-cheàrnach della, ach gu ìre nas lugha na anns a’ mutant monolithic della (Figear a bharrachd 12d–f). Tha a’ bhuaidh dòsaidh seo, còmhla ri dìth buaidh air lùbadh, a’ moladh gu bheil gnìomhachd RGL3 a tha air fhàgail anns a’ mutant ceithir-cheàrnach Della a’ cuingealachadh atharrachaidhean ann an treòrachadh roinneadh cealla air adhbhrachadh le call gnìomhachd DELLA agus gu bheil atharrachaidhean ann an roinnean cealla taobhach a’ tachairt mar fhreagairt do atharrachaidhean ann an gnìomhachd comharran GA seach atharrachaidhean ann an geoimeatraidh SAM. Mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, bidh am brosnaichear CUC2 a’ stiùireadh abairt IPR anns an SAM a’ tòiseachadh aig P4 (Figear a bharrachd 14a, b), agus an coimeas ri sin, bha meud nas lugha aig SAM pCUC2::gai-1-VENUS ach lùbadh nas àirde (Figear a bharrachd 14c–h). Dh’ fhaodadh an t-atharrachadh seo ann am morf-eòlas SAM pCUC2::gai-1-VENUS leantainn gu sgaoileadh eadar-dhealaichte de chuideaman meacanaigeach an taca ris an t-seòrsa fiadhaich, anns a bheil cuideaman cuairteachaidh àrd a’ tòiseachadh aig astar nas giorra bhon ionad SAM47. Air neo, dh’fhaodadh na h-atharrachaidhean ann am morf-eòlas pCUC2::gai-1-VENUS SAM a bhith mar thoradh air atharrachaidhean ann an feartan meacanaigeach roinneil air an adhbhrachadh le abairt thar-ghine48. Anns gach cùis, dh’fhaodadh seo buaidh atharrachaidhean ann an comharrachadh GA a chothromachadh gu ìre le bhith ag àrdachadh na coltachd gum bi ceallan a’ roinn san treòrachadh cuairteach/transverse, a’ mìneachadh ar beachdan.
Còmhla, tha an dàta againn a’ dearbhadh gu bheil pàirt ghnìomhach aig comharran GA nas àirde ann an treòrachadh taobhach plèana roinneadh cealla san IPR. Tha iad cuideachd a’ sealltainn gu bheil buaidh aig lùbadh meristem air treòrachadh plèana roinneadh cealla san IPR.
Tha treòrachadh transverse a’ phlèana roinneadh san IPR, air sgàth gnìomhachd àrd chomharran GA, a’ moladh gu bheil GA ag eagrachadh faidhle cealla radial san epidermis taobh a-staigh an SAM gus an eagrachadh ceallach a mhìneachadh a lorgar nas fhaide air adhart san internode epidermal. Gu dearbh, bha faidhlichean cealla mar sin rim faicinn gu tric ann an ìomhaighean SAM de mutants della global (Figear 6b). Mar sin, gus sgrùdadh nas mionaidiche a dhèanamh air gnìomh leasachaidh pàtran fànais chomharran GA san SAM, chleachd sinn ìomhaighean ùine-tuiteam gus mion-sgrùdadh a dhèanamh air eagrachadh fànais cheallan san IPR ann an lusan tar-ghineach seòrsa fiadhaich (Ler agus Col-0), mutants della global, agus pCUC2::gai-1-VENUS.
Fhuair sinn a-mach gun do sheall qmRGA gun do dh’àrdaich gnìomhachd chomharran GA anns an IPR bho P1/P2 agus gun do ràinig i an ìre as àirde aig P4, agus dh’fhan am pàtran seo seasmhach thar ùine (Figear 4a–f agus Figear a bharrachd 8c–f, k). Gus sgrùdadh a dhèanamh air eagrachadh fànais cheallan anns an IPR le comharra GA a bha a’ sìor fhàs, chomharraich sinn ceallan Ler IPR os cionn agus ri taobhan P4 a rèir an dàn leasachaidh a chaidh a sgrùdadh 34 uair an dèidh a’ chiad amharc, i.e., barrachd air dà àm plastid, a’ leigeil leinn ceallan IPR a leantainn rè leasachadh a’ phrìomh-chrios bho P1/P2 gu P4. Chleachd sinn trì dathan eadar-dhealaichte: buidhe airson na ceallan sin a chaidh an amalachadh a-steach don phrìomh-chrios faisg air P4, uaine dhaibhsan a bha anns an IPR, agus purpaidh dhaibhsan a ghabh pàirt anns an dà phròiseas (Figear 7a–c). Aig t0 (0 h), bha 1–2 sreathan de cheallan IPR rim faicinn air beulaibh P4 (Figear 7a). Mar a bha dùil, nuair a roinn na ceallan sin, rinn iad sin sa mhòr-chuid tron phlèana roinneadh transverse (Figearan 7a–c). Fhuaireadh toraidhean coltach ri chèile le bhith a’ cleachdadh Col-0 SAM (a’ cur fòcas air P3, aig a bheil a chrìoch a’ pasgadh san aon dòigh ri P4 ann an Ler), ged a bha am pasgadh a chaidh a chruthachadh aig a’ chrìoch fhlùraichean a’ falach nan ceallan IPR nas luaithe san genotype seo (Figear 7g–i). Mar sin, bidh pàtran roinneadh cheallan IPR ag eagrachadh nan ceallan ro-làimh ann an sreathan radial, mar ann an internods. Tha eagrachadh nan sreathan radial agus suidheachadh cheallan IPR eadar buill-bodhaig leantainneach a’ moladh gur e sinnsearan internodal a tha sna ceallan seo.
An seo, leasaich sinn biosensor comharran GA ratiometric, qmRGA, a leigeas le mapadh cainneachdail de ghnìomhachd comharran GA mar thoradh air dùmhlachdan GA agus gabhadair GA còmhla agus aig an aon àm a’ lughdachadh bacadh air slighean comharran endogenous, agus mar sin a’ toirt seachad fiosrachadh mu ghnìomhachd GA aig an ìre ceallach. Gus seo a dhèanamh, thog sinn pròtain DELLA atharraichte, mRGA, a tha air a’ chomas ceangal ri com-pàirtichean eadar-obrachaidh DELLA a chall ach a tha fhathast mothachail air proteolysis air adhbhrachadh le GA. Bidh qmRGA a’ freagairt ri atharrachaidhean exogenous agus endogenous ann an ìrean GA, agus tha na feartan mothachaidh fiùghantach aige a’ comasachadh measadh a dhèanamh air atharrachaidhean spatiotemporal ann an gnìomhachd comharran GA rè leasachadh. Tha qmRGA cuideachd na inneal gu math sùbailte oir faodar atharrachadh gu diofar fhigheagan le bhith ag atharrachadh an neach-adhartachaidh a thathas a’ cleachdadh airson a chur an cèill (ma tha sin riatanach), agus leis an nàdar glèidhte a th’ aig slighe comharran GA agus motif PFYRE thar angiosperms, tha e coltach gum bi e so-ghluasadach gu gnèithean eile22. A rèir seo, chaidh a shealltainn cuideachd gu bheil mùthadh co-ionann ann am pròtain rìs SLR1 DELLA (HYY497AAA) a’ cur bacadh air gnìomhachd casg-fhàs SLR1 agus dìreach beagan a’ lughdachadh a lobhadh a tha air a mheadhanachadh le GA, coltach ri mRGA23. Gu sònraichte, sheall sgrùdaidhean o chionn ghoirid ann an Arabidopsis gun do dh’ atharraich aon mhùthadh amino-aigéid ann an raon PFYRE (S474L) gnìomhachd tar-sgrìobhaidh RGA gun a bhith a’ toirt buaidh air a chomas eadar-obrachadh le com-pàirtichean factar tar-sgrìobhaidh50. Ged a tha am mùthadh seo glè fhaisg air na 3 ath-chur amino-aigéid a tha an làthair ann am mRGA, tha na sgrùdaidhean againn a’ sealltainn gu bheil an dà mhùthadh seo ag atharrachadh feartan sònraichte DELLA. Ged a tha a’ mhòr-chuid de chom-pàirtichean factar tar-sgrìobhaidh a’ ceangal ri raointean LHR1 agus SAW de DELLA26,51, faodaidh cuid de amino-aigéid glèidhte ann an raon PFYRE cuideachadh le bhith a’ daingneachadh nan eadar-obrachaidhean sin.
Tha leasachadh internode na phrìomh fheart ann an ailtireachd planntrais agus leasachadh toraidh. Nochd qmRGA gnìomhachd chomharran GA nas àirde ann an ceallan progenitor internode IPR. Le bhith a’ cothlamadh ìomhaighean cainneachdail agus gintinneachd, sheall sinn gu bheil pàtrain comharran GA a’ cur thairis air plèanaichean roinneadh cealla cruinn / transverse ann an epidermis SAM, a’ cumadh eagrachadh roinneadh cealla a tha a dhìth airson leasachadh internode. Chaidh grunn riaghladairean de stiùireadh plèana roinneadh cealla a chomharrachadh rè leasachadh52,53. Tha an obair againn a’ toirt seachad eisimpleir soilleir de mar a bhios gnìomhachd chomharran GA a’ riaghladh a’ pharamadair ceallach seo. Faodaidh DELLA eadar-obrachadh le co-thàthaidhean pròtain ro-fhillte41, agus mar sin faodaidh comharran GA stiùireadh plèana roinneadh cealla a riaghladh le bhith a’ toirt buaidh dhìreach air stiùireadh microtubule cortical40,41,54,55. Sheall sinn gu h-obann ann an SAM, nach e leudachadh no roinneadh cealla an co-dhàimh de ghnìomhachd chomharran GA nas àirde, ach dìreach anisotropy fàis, a tha a rèir buaidh dhìreach GA air stiùireadh roinneadh cealla anns an IPR. Ach, chan urrainn dhuinn a dhiùltadh gum faodadh a’ bhuaidh seo a bhith neo-dhìreach cuideachd, mar eisimpleir air a mheadhanachadh le bogachadh balla cealla air adhbhrachadh le GA56. Bidh atharrachaidhean ann an feartan ballachan cealla ag adhbhrachadh cuideam meacanaigeach57,58, a dh’ fhaodadh buaidh a thoirt cuideachd air treòrachadh plèana roinneadh cealla le bhith a’ toirt buaidh air treòrachadh microtubules cortical39,46,59. Dh’ fhaodadh buaidhean còmhla cuideam meacanaigeach air adhbhrachadh le GA agus riaghladh dìreach treòrachadh microtubule le GA a bhith an sàs ann a bhith a’ gineadh pàtran sònraichte de threòrachadh roinneadh cealla anns an IPR gus internods a mhìneachadh, agus tha feum air tuilleadh sgrùdaidhean gus am beachd seo a dhearbhadh. San aon dòigh, tha sgrùdaidhean roimhe air cudromachd nam pròtainean eadar-ghnìomhach DELLA TCP14 agus 15 ann an smachd cruthachadh internode60,61 a shoilleireachadh agus dh’ fhaodadh na factaran sin gnìomh GA a mheadhanachadh còmhla ri BREVIPEDICELLUS (BP) agus PENNYWISE (PNY), a bhios a’ riaghladh leasachadh internode agus air an sealltainn gu bheil buaidh aca air comharran GA2,62. Leis gu bheil DELLAn ag eadar-obrachadh le slighean comharran brassinosteroid, ethylene, searbhag jasmonic, agus searbhag abscisic (ABA)63,64 agus gum faod na hormonaichean sin buaidh a thoirt air treòrachadh microtubule65, faodaidh buaidhean GA air treòrachadh roinneadh cealla a bhith air an eadar-mheadhanachadh le hormonaichean eile cuideachd.
Sheall sgrùdaidhean tràtha citologach gu bheil feum air an dà chuid roinnean a-staigh agus a-muigh SAM Arabidopsis airson leasachadh internode2,42. Tha an fhìrinn gu bheil GA a’ riaghladh roinneadh cealla gu gnìomhach anns na figheagan a-staigh12 a’ toirt taic do dh’ obair dhùbailte aig GA ann a bhith a’ riaghladh meristem agus meud internode anns an SAM. Tha pàtran roinneadh cealla stiùiridh cuideachd air a riaghladh gu teann anns an fhigheag SAM a-staigh, agus tha an riaghladh seo riatanach airson fàs gas52. Bidh e inntinneach sgrùdadh a dhèanamh a bheil pàirt aig GA cuideachd ann a bhith a’ stiùireadh plèana roinneadh cealla ann an eagrachadh SAM a-staigh, agus mar sin a’ sioncronachadh sònrachadh agus leasachadh internods taobh a-staigh an SAM.
Chaidh lusan fhàs in vitro ann an ùir no meadhan 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) le 1% siùcros agus 1% agar (Sigma) air a chur ris fo chumhachan àbhaisteach (16 uair a thìde de sholas, 22 °C), ach a-mhàin airson deuchainnean fàs hypocotyl agus freumhaichean anns an deach sìol-chraobhan fhàs air truinnsearan dìreach fo sholas cunbhalach agus 22 °C. Airson deuchainnean nitrate, chaidh lusan fhàs air meadhan MS atharraichte (meadhan planntrais bioWORLD) le nitrate iomchaidh (0 no 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% siùcros agus 1% A-agar (Sigma) air a chur ris fo chumhachan latha fada.
Chaidh cDNA GID1a a chaidh a chur a-steach do pDONR221 ath-mheasgachadh le pDONR P4-P1R-pUBQ10 agus pDONR P2R-P3-mCherry a-steach do pB7m34GW gus pUBQ10::GID1a-mCherry a chruthachadh. Chaidh DNA IDD2 a chaidh a chur a-steach do pDONR221 ath-mheasgachadh a-steach do pB7RWG266 gus p35S:IDD2-RFP a chruthachadh. Gus pGID1b::2xmTQ2-GID1b a chruthachadh, chaidh criomag 3.9 kb suas an abhainn bhon roinn còdaidh GID1b agus criomag 4.7 kb anns an robh cDNA GID1b (1.3 kb) agus crìochnaiche (3.4 kb) a mheudachadh an toiseach a’ cleachdadh nam prìmearan ann an Clàr-taice 3 agus an uairsin gan cur a-steach do pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) agus pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), fa leth, agus mu dheireadh gan ath-chur còmhla ri pDONR221 2xmTQ268 a-steach don vectar targaid pGreen 012567 a’ cleachdadh clònadh Gateway. Gus pCUC2::LSSmOrange a chruthachadh, chaidh sreath brosnachaidh CUC2 (3229 bp suas an abhainn bho ATG) agus an uair sin sreath còdaidh mOrange mòr le gluasad Stokes (LSSmOrange)69 leis a’ chomharra ionadail niùclasach N7 agus an crìochnaiche tar-sgrìobhaidh NOS a chruinneachadh a-steach don vectar targaideadh kanamycin pGreen a’ cleachdadh siostam ath-chur 3-bloigh Gateway (Invitrogen). Chaidh am vectar dà-chànanach planntrais a thoirt a-steach do shreath GV3101 de Agrobacterium tumefaciens agus a thoirt a-steach do dhuilleagan Nicotiana benthamiana leis an dòigh-in-shìoladh Agrobacterium agus a-steach do Arabidopsis thaliana Col-0 leis an dòigh-tumaidh fhlùraichean, fa leth. Chaidh pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry agus pCLV3::mCherry-NLS qmRGA a sgaradh bho shliochd F3 agus F1 nan croisean fa leth, fa leth.
Chaidh hibridachadh RNA in situ a dhèanamh air bàrr bhrògan mu 1 cm a dh'fhaid72, a chaidh a chruinneachadh agus a dhaingneachadh sa bhad ann am fuasgladh FAA (3.7% formaldehyde, 5% searbhag aiseatach, 50% ethanol) ro-fhuaraichte gu 4 °C. Às dèidh 2 làimhseachadh falamh × 15 mionaid, chaidh an daingneachadh atharrachadh agus chaidh na sampallan a ghoir thar oidhche. Chaidh cDNAn GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, agus RGL3 agus probes antisense gu na 3′-UTRan aca a cho-chur ri chèile a’ cleachdadh nam prìomhairean a chithear ann an Clàr Taiceil 3 mar a chaidh a mhìneachadh le Rosier et al.73. Chaidh proban le bileagan digoxigenin a lorg le dìonachd le bhith a’ cleachdadh antibodies digoxigenin (caolachadh 3000-fhillte; Roche, àireamh catalog: 11 093 274 910), agus chaidh earrannan a dhath le fuasgladh 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, caolachadh 250-fhillte)/nitroblue tetrazolium (NBT, caolachadh 200-fhillte).
Àm puist: 10 Gearran 2025