Tha fàs shoot apical meristem (SAM) deatamach airson ailtireachd gas. Hormonan lusangibberellinsTha prìomh dhleastanasan aig (GAn) ann a bhith a’ co-òrdanachadh fàs planntrais, ach chan eil tuigse fhathast air a’ phàirt aca san SAM. An seo, leasaich sinn biosensor reusanta de chomharran GA le bhith ag innleachadh pròtain DELLA gus a dhleastanas riaghlaidh riatanach a chumail fodha ann am freagairt tar-sgrìobhaidh GA fhad ‘s a bha e a’ gleidheadh a ìsleachadh air aithne GA. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil am biosensor seo stèidhichte air truailleadh a’ clàradh gu ceart atharrachaidhean ann an ìrean GA agus mothachadh cealla rè leasachadh. Chleachd sinn am biosensor seo gus gnìomhachd comharran GA a mhapadh san SAM. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil comharran GA àrd an làthair sa mhòr-chuid ann an ceallan a tha suidhichte eadar organ primordia, a tha nan ro-ruitheadairean gu ceallan internode. A’ cleachdadh dòighean-obrach buannachd is call-gnìomh, bidh sinn a’ sealltainn tuilleadh gu bheil GA a’ riaghladh treòrachadh an itealain roinn cealla, a’ stèidheachadh eagrachadh ceallach canonical internodes, agus mar sin a’ brosnachadh sònrachadh internode san SAM.
Anns an t-seilg meristem apical (SAM), a tha suidhichte aig mullach an t-seilg, tha àite sònraichte de cheallan-gas a bhios an gnìomhachd aca a’ gineadh buill-bodhaig taobhach agus nodan gas ann an dòigh modular agus ath-aithriseach fad beatha a’ phlannt. Tha gach aon de na h-aonadan ath-chuairteachaidh sin, no nodan planntrais, a’ toirt a-steach internodes agus organan taobhach aig na nodan, agus meristems axillary ann an axils na duilleige1. Bidh fàs agus eagrachadh nodan planntrais ag atharrachadh rè leasachadh. Ann an Arabidopsis, tha fàs internodal air a chumail fodha aig ìre an fhàsmhorachd, agus tha meristems axillary fhathast nan tàmh ann an axils duilleagan rosette. Rè an gluasad gu ìre an fhlùraichean, bidh an SAM gu bhith na meristem inflorescence, a ’gineadh internodes fada agus gucagan axillary, meuran ann an axils duilleagan cauline, agus nas fhaide air adhart, flùraichean gun duilleach2. Ged a tha sinn air adhartas mòr a dhèanamh ann a bhith a’ tuigsinn nan dòighean a tha a’ cumail smachd air tòiseachadh dhuilleagan, fhlùraichean is gheugan, chan eil mòran fios againn mu mar a dh’ èiricheas internodes.
Cuidichidh tuigse air cuairteachadh spatiotemporal GAn le tuigse nas fheàrr fhaighinn air gnìomhan nan hormonaichean sin ann an diofar fhigheagan agus aig diofar ìrean leasachaidh. Tha sealladh air truailleadh fusion RGA-GFP air a chuir an cèill fo ghnìomhachd an neach-adhartachaidh aige fhèin a’ toirt seachad fiosrachadh cudromach mu riaghladh ìrean GA iomlan ann am freumhan15,16. Ach, tha faireachdainn RGA ag atharrachadh thar nèapraigean17 agus air a riaghladh le GA18. Mar sin, dh’ fhaodadh faireachdainn eadar-dhealaichte de neach-adhartachaidh RGA leantainn gu am pàtran flùraiseach a chaidh fhaicinn le RGA-GFP agus mar sin chan eil an dòigh seo cainneachdail. O chionn ghoirid, nochd fluorescein bith-ghnìomhach (Fl) le bileagan GA19,20 cruinneachadh GA anns an endocortex freumh agus riaghladh ìrean cealla le còmhdhail GA. O chionn ghoirid, sheall an sensor GA FRET nlsGPS1 gu bheil ìrean GA co-cheangailte ri leudachadh cealla ann am freumhan, filamentan, agus hypocotyls dorcha21. Ach, mar a chunnaic sinn, chan e dùmhlachd GA an aon pharamadair a tha a’ cumail smachd air gnìomhachd comharran GA, leis gu bheil e an urra ri pròiseasan mothachaidh iom-fhillte. An seo, a’ togail air ar tuigse air slighean soidhneadh DELLA agus GA, tha sinn ag aithris air leasachadh agus comharrachadh biosensor reusanachaidh stèidhichte air truailleadh airson comharran GA. Gus am biosensor cainneachdail seo a leasachadh, chleachd sinn RGA a bha mothachail air GA mutant a chaidh a cheangal ri pròtain flùraiseach agus a chuir an cèill gu h-iomlan ann am figheagan, a bharrachd air pròtain flùraiseach neo-mhothachail GA. Tha sinn a’ sealltainn nach bi na fusions pròtain mutant RGA a’ cur bacadh air comharran GA endogenous nuair a thèid an cur an cèill gu h-iomlan, agus gum faod am biosensor seo gnìomhachd comharran a thomhas a thig bho gach cuid cuir a-steach GA agus giullachd chomharran GA leis an inneal mothachaidh le rùn spatiotemporal àrd. Chleachd sinn am biosensor seo gus cuairteachadh spatiotemporal gnìomhachd comharran GA a mhapadh agus tomhas mar a bhios GA a’ riaghladh giùlan cealla anns an epidermis SAM. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil GA a’ riaghladh treòrachadh plèana roinneadh cheallan SAM a tha suidhichte eadar organ primordia, agus mar sin a’ mìneachadh eagrachadh ceallach canonical an internode.
Mu dheireadh, dh’ fhaighnich sinn am b’ urrainn dha qmRGA cunntas a thoirt air atharrachaidhean ann an ìrean GA endogenous a’ cleachdadh hypocotyls a tha a’ fàs. Sheall sinn roimhe seo gu bheil nitrate a’ brosnachadh fàs le bhith ag àrdachadh synthesis GA agus, an uair sin, truailleadh DELLA34. A rèir sin, thug sinn an aire gu robh fad hypocotyl ann am pUBQ10:: sìol-chraobhan qmRGA a chaidh fhàs fo sholarachadh pailt nitrate (10 mM NO3 -) gu math nas fhaide na sin ann an sìolaidhean a chaidh fhàs fo chumhachan le dìth nitrate (Fig. 6a a bharrachd). Co-chòrdail ris an fhreagairt fàis, bha comharran GA nas àirde ann an hypocotyls de shìol-chraobhan a chaidh fhàs fo chumhachan 10 mM NO3 - na ann an sìolaidhean a chaidh fhàs às aonais nitrate (Fig. 6b, c). Mar sin, tha qmRGA cuideachd a’ comasachadh sùil a chumail air atharrachaidhean ann an comharran GA mar thoradh air atharrachaidhean annasach ann an dùmhlachd GA.
Gus tuigsinn a bheil gnìomhachd comharran GA a chaidh a lorg le qmRGA an urra ri dùmhlachd GA agus tuigse GA, mar a bhiodh dùil stèidhichte air dealbhadh an mothachaidh, rinn sinn mion-sgrùdadh air faireachdainn nan trì gabhadan GID1 ann am figheagan fàsmhor agus gintinn. Ann an sìolaidhean, sheall loidhne neach-aithris GID1-GUS gun robh GID1a agus c air an cur an cèill gu mòr ann an cotyledons (Fig. 3a–c). A bharrachd air an sin, chaidh na trì gabhadan a chuir an cèill ann an duilleagan, primordia root lateral, molaidhean freumha (ach a-mhàin bun-stèidh GID1b), agus an siostam falamh (Fig. 3a–c). Anns an SAM inflorescence, lorg sinn comharran GUS a-mhàin airson GID1b agus 1c (Fig. 7a–c a bharrachd). Dhearbh hybridization in situ na pàtrain faireachdainn sin agus sheall iad tuilleadh gun robh GID1c air a chuir an cèill gu co-ionnan aig ìrean ìosal anns an SAM, ach sheall GID1b faireachdainn nas àirde aig iomall an SAM (Fig. 7d–l Leasachail). Nochd am measgachadh eadar-theangachaidh pGID1b::2xmTQ2-GID1b cuideachd raon ìre de abairt GID1b, bho abairt ìosal no gun abairt ann am meadhan an SAM gu faireachdainn àrd aig crìochan organ (Fig. 7m a bharrachd). Mar sin, chan eil gabhadairean GID1 air an sgaoileadh gu co-ionnan air feadh agus taobh a-staigh fhigheagan. Ann an deuchainnean às dèidh sin, thug sinn fa-near cuideachd gun do chuir cus cuideam air GID1 (pUBQ10:: GID1a-mCherry) barrachd cugallachd qmRGA ann an hypocotyls gu tagradh GA taobh a-muigh (Fig. 3d, e). An coimeas ri sin, bha fluorescence air a thomhas le qd17mRGA anns an hypocotyl neo-mhothachail a thaobh làimhseachadh GA3 (Fig. 3f, g). Airson an dà mheasadh, chaidh dèiligeadh ri sìol-chraobhan le dùmhlachd àrd de GA (100 μM GA3) gus giùlan luath an sensor a mheasadh, far an deach an comas ceangal ris an gabhadair GID1 àrdachadh no a chall. Còmhla, tha na co-dhùnaidhean sin a’ dearbhadh gu bheil am biosensor qmRGA a’ frithealadh gnìomh aonaichte mar sensor GA agus GA, agus a’ moladh gum faod faireachdainn eadar-dhealaichte den gabhadair GID1 atharrachadh mòr a dhèanamh air emissivity an sensor.
Gu ruige seo, tha cuairteachadh chomharran GA anns an SAM fhathast neo-shoilleir. Mar sin, chleachd sinn planntaichean a tha a’ cur an cèill qmRGA agus am pCLV3::mCherry-NLS neach-aithris cealla gas35 gus mapaichean cainneachdail àrd-rèiteachaidh de ghnìomhachd comharran GA obrachadh a-mach, le fòcas air an ìre L1 (epidermis; Fig. 4a, b, faic Dòighean agus Dòighean Leasachail), leis gu bheil prìomh àite aig L1 ann a bhith a’ cumail smachd air fàs SAM. An seo, thug abairt pCLV3 :: mCherry-NLS seachad puing iomraidh geoimeatrach stèidhichte airson mion-sgrùdadh a dhèanamh air cuairteachadh spatiotemporal gnìomhachd comharran GA37. Ged a tha GA air a mheas riatanach airson leasachadh organ taobhach4, chunnaic sinn gu robh comharran GA ìosal anns a’ phrimordium fhlùraichean (P) a’ tòiseachadh bhon ìre P3 (Fig. 4a, b), ach bha gnìomhachd meadhanach aig primordiums òga P1 agus P2 coltach ris an fhear sa mheadhan sgìre (Fig. 4a, b). Chaidh gnìomhachd comharran GA nas àirde a lorg aig crìochan organ primordium, a’ tòiseachadh aig P1/P2 (aig taobhan na crìche) agus a’ dol gu àirde aig P4, a bharrachd air anns a h-uile cealla den roinn iomaill a tha suidhichte eadar an primordia (Fig. 4a, b agus Fig. 8a, b). Chaidh an gnìomhachd comharrachaidh GA nas àirde seo fhaicinn chan ann a-mhàin anns an epidermis ach cuideachd anns na sreathan L2 agus L3 àrd (Fig. 8b a bharrachd). Dh’ fhan pàtran nan comharran GA a chaidh a lorg anns an SAM a’ cleachdadh qmRGA cuideachd gun atharrachadh thar ùine (Fig. 8c–f, k). Ged a chaidh an togail qd17mRGA a lughdachadh gu riaghailteach anns an SAM de phlanntaichean T3 bho chòig loidhnichean neo-eisimeileach a chomharraich sinn gu mionaideach, b’ urrainn dhuinn mion-sgrùdadh a dhèanamh air na pàtrain flùraiseach a fhuaireadh leis an pRPS5a:: VENUS-2A-TagBFP construct (Fig. 8g – j, l). Anns an loidhne smachd seo, cha deach ach atharrachaidhean beaga anns a’ cho-mheas fluorescence a lorg anns an SAM, ach anns an ionad SAM chunnaic sinn lùghdachadh soilleir gun dùil ann an VENUS co-cheangailte ri TagBFP. Tha seo a’ dearbhadh gu bheil am pàtran comharran a chunnaic qmRGA a’ nochdadh mar a tha mRGA-VENUS an urra ri GA, ach tha e cuideachd a’ sealltainn gum faodadh qmRGA cus tuairmse a dhèanamh air gnìomhachd chomharran GA anns an ionad meristem. Ann an geàrr-chunntas, tha na toraidhean againn a’ nochdadh pàtran comharran GA a tha gu sònraichte a’ nochdadh cuairteachadh primordia. Tha an sgaoileadh seo den roinn eadar-phrìomhach (IPR) mar thoradh air stèidheachadh mean air mhean de ghnìomhachd comharran GA àrd eadar an primordium a tha a’ leasachadh agus an roinn mheadhanach, agus aig an aon àm tha gnìomhachd comharran GA anns a ’phrimordium a’ lughdachadh (Fig. 4c, d).
Tha cuairteachadh gabhadairean GID1b agus GID1c (faic gu h-àrd) a’ moladh gu bheil faireachdainn eadar-dhealaichte de luchd-gabhail GA a’ cuideachadh le cumadh a thoirt air pàtran gnìomhachd comharran GA anns an SAM. Bha sinn a’ faighneachd am faodadh cruinneachadh eadar-dhealaichte de GA a bhith na lùib. Gus sgrùdadh a dhèanamh air a’ chomas seo, chleachd sinn an sensor nlsGPS1 GA FRET21. Chaidh tricead gnìomhachd nas àirde a lorg anns an SAM de nlsGPS1 air a làimhseachadh le 10 μM GA4 + 7 airson 100 min (Fig. Nochd cuairteachadh spàsail tricead gnìomhachaidh nlsGPS1 ìrean GA coimeasach ìosal ann an sreathan a-muigh an SAM, ach sheall e gun robh iad air an àrdachadh sa mheadhan agus aig crìochan an SAM (Fig. 4e agus Fig. 9a,c). Tha seo a’ nochdadh gu bheil GA cuideachd air a chuairteachadh anns an SAM le pàtran spàsail a tha coltach ris an fhear a nochd le qmRGA. Mar dhòigh-obrach co-phàirteach, dhèilig sinn cuideachd ris an SAM le fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) no Fl leis fhèin mar smachd àicheil. Chaidh an comharra Fl a sgaoileadh air feadh an SAM, a 'gabhail a-steach an roinn mheadhanach agus primordium, ged a bha e nas ìsle (Fig. 4j agus Fig. 10d a bharrachd). An coimeas ri sin, chruinnich na trì GA-Fl gu sònraichte taobh a-staigh crìochan primordium agus gu diofar ìrean sa chòrr den IPR, le GA7-Fl a’ cruinneachadh anns an raon as motha san IPR (Fig. 4k agus Fig. 10a,b). Sheall tomhas de dhian fhuaim-fhuaimneachd gun robh an co-mheas dian IPR gu neo-IPR nas àirde ann an SAM air a làimhseachadh le GA-Fl an coimeas ri SAM air a làimhseachadh le Fl (Fig. 4l agus Fig. 10c Leasachail). Còmhla, tha na co-dhùnaidhean sin a 'moladh gu bheil GA an làthair aig co-chruinneachaidhean nas àirde ann an ceallan IPR a tha nas fhaisge air a' chrìoch organ. Tha seo a’ moladh gu bheil pàtran gnìomhachd comharrachaidh SAM GA mar thoradh air an dà chuid abairt eadar-dhealaichte de luchd-gabhail GA agus cruinneachadh eadar-dhealaichte de GA ann an ceallan IPR faisg air crìochan organ. Mar sin, nochd ar mion-sgrùdadh pàtran spatiotemporal ris nach robh dùil de chomharran GA, le gnìomhachd nas ìsle ann am meadhan agus primordium an SAM agus gnìomhachd nas àirde san IPR anns an sgìre iomaill.
Gus tuigse fhaighinn air àite gnìomhachd comharrachaidh GA eadar-dhealaichte anns an SAM, rinn sinn mion-sgrùdadh air a’ cho-dhàimh eadar gnìomhachd comharran GA, leudachadh cealla, agus roinneadh cealla a’ cleachdadh ìomhaighean fìor-ùine ùine-ama den SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Leis an àite a tha aig GA ann an riaghladh fàis, bha dùil ri co-dhàimh adhartach le paramadairean leudachadh cealla. Mar sin, rinn sinn coimeas an toiseach air mapaichean gnìomhachd comharran GA le mapaichean de ìre fàis uachdar cealla (mar neach-ionaid airson neart leudachadh cealla airson cealla sònraichte agus airson ceallan nighean aig roinneadh) agus le mapaichean de fhàs anisotropy, a bhios a’ tomhas stiùireadh leudachadh cealla (cuideachd air a chleachdadh an seo airson cealla sònraichte agus airson ceallan nighean aig roinneadh; Fig. 5a,b, faic Dòighean agus Dòighean Leasachail). Tha na mapaichean againn de ìre fàis uachdar cealla SAM co-chòrdail ri beachdan roimhe38,39, le ìrean fàis as ìsle aig a’ chrìch agus na h-ìrean fàis as àirde ann an leasachadh fhlùraichean (Fig. 5a). Sheall mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) gu robh gnìomhachd comharran GA co-cheangailte gu àicheil ri dian fàs uachdar cealla (Figear 5c). Sheall sinn cuideachd gu robh na prìomh làmhagan atharrachaidh, a’ toirt a-steach cuir a-steach comharran GA agus dian fàis, orthogonal ris an stiùireadh a chaidh a dhearbhadh le abairt àrd CLV3, a’ dearbhadh gun deach ceallan a-mach à ionad SAM anns na mion-sgrùdaidhean a bha air fhàgail. Dhaingnich mion-sgrùdadh co-dhàimh Spearman toraidhean PCA (Figear 5d), a’ nochdadh nach do dh’ adhbhraich comharran GA nas àirde san IPR leudachadh cealla nas àirde. Ach, nochd mion-sgrùdadh co-dhàimh co-dhàimh bheag adhartach eadar gnìomhachd comharran GA agus anisotropy fàis (Figear 5c, d), a’ moladh gu bheil comharran GA nas àirde san IPR a’ toirt buaidh air stiùir fàs cealla agus is dòcha suidheachadh plèana roinn cealla.
a, b Bha mapaichean teas de dh'fhàs cuibheasach uachdar (a) agus anisotropy fàis (b) ann an SAM cuibheasach thairis air seachd lusan neo-eisimeileach (air an cleachdadh mar luchd-ionaid airson neart agus stiùireadh leudachadh cealla, fa leth). c Bha mion-sgrùdadh PCA a’ toirt a-steach na caochladairean a leanas: comharra GA, dian fàs uachdar, anisotropy fàs uachdar, agus abairt CLV3. Bha pàirt 1 PCA gu ìre mhòr co-cheangailte gu àicheil ri dian fàs uachdar agus air a cho-cheangal gu dearbhach le comharra GA. Bha co-phàirt PCA 2 gu ìre mhòr co-cheangailte gu dearbhach ri anisotropy fàs uachdar agus co-cheangal àicheil ri abairt CLV3. Tha ceudadan a’ riochdachadh an atharrachaidh a tha air a mhìneachadh le gach pàirt. d Mion-sgrùdadh co-dhàimh Spearman eadar comharra GA, dian fàs uachdar, agus anisotropy fàs uachdar aig an sgèile clò ach a-mhàin CZ. 'S e an àireamh air an làimh dheis an luach Spearman rho eadar dà chaochladair. Tha rionnagan a’ comharrachadh chùisean far a bheil an co-dhàimh/co-dhàimh àicheil air leth cudromach. e Sealladh 3D de cheallan Col-0 SAM L1 le microscopy confocal. Tha ballachan cealla ùra a chaidh a chruthachadh anns an SAM (ach chan e am primordium) aig 10 h air an dath a rèir an luachan ceàrn. Tha am bàr dath air a shealltainn anns an oisean gu h-ìosal air an làimh dheis. Tha an inset a’ sealltainn an ìomhaigh 3D co-fhreagarrach aig 0 h. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean co-chosmhail. f Bidh plotaichean bogsa a’ taisbeanadh ìrean roinneadh cealla ann an IPR agus neo-IPR Col-0 SAM (n = 10 planntrais neo-eisimeileach). Tha an loidhne sa mheadhan a’ sealltainn am meadhan, agus tha crìochan a’ bhogsa a’ comharrachadh an 25mh agus an 75mh ceudadan. Bidh whiskers a’ comharrachadh na luachan as ìsle agus as àirde a chaidh a dhearbhadh le bathar-bog R. Chaidh luachan P fhaighinn le deuchainn-t dà-earball Welch. g, h Diagram sgeamach a’ sealltainn (g) mar a thomhaiseas tu ceàrn a’ bhalla cealla ùr (magenta) a thaobh an t-slighe radial bho mheadhan an SAM (loidhne dotagach geal) (chan eilear a’ beachdachadh ach air luachan ceàrnach geur, ie, 0–90 °), agus (h) an treòrachadh cearcallach/taobhach is radial taobh a-staigh a’ mheiristem. i Histograman tricead de stiùireadh plèana roinn cealla thairis air an SAM (gorm dorcha), IPR (gorm meadhanach), agus neo-IPR (gorm aotrom), fa leth. Chaidh luachan P fhaighinn le deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earball. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean co-chosmhail. j Histograman tricead de stiùireadh plèana roinneadh cealla den IPR timcheall air P3 (uaine aotrom), P4 (uaine meadhanach), agus P5 (uaine dorcha), fa leth. Chaidh luachan P fhaighinn le deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earball. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean co-chosmhail.
Mar sin, rinn sinn ath-sgrùdadh air a’ cho-dhàimh eadar comharran GA agus gnìomhachd roinneadh cealla le bhith a’ comharrachadh ballachan cealla a chaidh an cruthachadh às ùr tron assay (Fig. 5e). Leig an dòigh-obrach seo leinn tricead agus stiùireadh roinneadh cealla a thomhas. Gu h-iongantach, lorg sinn gu robh tricead roinnean cealla anns an IPR agus an còrr den SAM (neo-IPR, Fig. 5f) coltach ris, a 'sealltainn nach eil eadar-dhealachaidhean ann an comharran GA eadar ceallan IPR agus neo-IPR a' toirt buaidh mhòr air roinneadh cealla. Thug seo, agus an co-dhàimh adhartach eadar comharran GA agus anisotropy fàis, sinn gu bhith a’ beachdachadh am faodadh gnìomhachd comharran GA buaidh a thoirt air stiùireadh plèana roinn cealla. Thomhais sinn stiùireadh a’ bhalla cealla ùr mar cheàrn geur an coimeas ris an axis radial a bha a’ ceangal an ionaid meristem agus meadhan a’ bhalla cealla ùr (Fig. 5e-i) agus chunnaic sinn claonadh soilleir airson ceallan a roinn aig ceàrnan faisg air 90 ° an coimeas ris an axis radial, leis na triceadan as àirde air am faicinn aig 70–80 ° (23.28%) (23.28%). 5e, i), a' freagairt ri roinnean cealla anns an t-slighe circumferential/transverse (Fig. 5h). Gus sgrùdadh a dhèanamh air na tha comharran GA a’ cur ris a’ ghiùlan roinneadh cealla seo, rinn sinn mion-sgrùdadh air paramadairean roinn cealla anns an IPR agus neo-IPR air leth (Fig. 5i). Chunnaic sinn gu robh an cuairteachadh ceàrn roinne ann an ceallan IPR eadar-dhealaichte bho sin ann an ceallan neo-IPR no ann an ceallan anns an SAM gu lèir, le ceallan IPR a’ nochdadh cuibhreann nas àirde de roinnean cealla taobhach / cearcallach, ie, 70-80 ° agus 80-90 ° (33.86% agus 30.71%, fa leth, cuibhreannan co-fhreagarrach) (Fig. 5i). Mar sin, nochd na beachdan againn ceangal eadar comharran GA àrd agus stiùireadh plèana roinneadh cealla faisg air an t-slighe circumferential, coltach ris a’ cho-cheangal eadar gnìomhachd comharran GA agus anisotropy fàis (Fig. 5c, d). Gus glèidhteachas spàsail a’ chomainn seo a stèidheachadh, thomhais sinn stiùireadh plèana roinne ann an ceallan IPR timcheall air a’ phrimordium a’ tòiseachadh bho P3, leis gun deach an gnìomhachd comharran GA as àirde a lorg san roinn seo a’ tòiseachadh bho P4 (Fig. 4). Cha do sheall ceàrnan roinneadh an IPR timcheall air P3 agus P4 eadar-dhealachaidhean cudromach gu staitistigeil, ged a chaidh barrachd tricead de roinnean cealla taobhach fhaicinn anns an IPR timcheall air P4 (Fig. 5j). Ach, anns na ceallan IPR timcheall air P5, dh'fhàs an eadar-dhealachadh ann an treòrachadh plèana roinn cealla gu bhith cudromach gu staitistigeil, le àrdachadh geur ann an tricead roinnean cealla transverse (Fig. 5j). Còmhla, tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gum faod comharran GA smachd a chumail air treòrachadh roinnean cealla san SAM, a tha co-chòrdail ri aithisgean roimhe40,41 gum faod comharran GA àrd stiùireadh taobhach roinnean cealla san IPR.
Thathas an dùil nach tèid ceallan san IPR a thoirt a-steach do primordia ach an àite sin ann an internodes2,42,43. Dh’ fhaodadh mar thoradh air treòrachadh transverse de roinnean cealla san IPR eagrachadh àbhaisteach de shreathan fad-ùine co-shìnte de cheallan epidermal ann an internodes. Tha na beachdan a tha air am mìneachadh gu h-àrd a’ nochdadh gu bheil e coltach gum bi pàirt aig comharran GA sa phròiseas seo le bhith a’ riaghladh slighe roinneadh cealla.
Tha call gnìomh grunn ghinean DELLA a’ leantainn gu freagairt GA bun-reachdail, agus faodar della mutants a chleachdadh gus am beachd-bharail seo a dhearbhadh44. Rinn sinn mion-sgrùdadh an toiseach air pàtrain faireachdainn còig ginean DELLA anns an SAM. Nochd measgachadh tar-sgrìobhaidh den loidhne GUS45 gun robh GAI, RGA, RGL1, agus RGL2 (gu ìre nas lugha) air an cur an cèill anns an SAM (Fig. 11a–d a bharrachd). Sheall tar-chur in situ tuilleadh gu bheil GAI mRNA a’ cruinneachadh gu sònraichte ann am primordia agus a’ leasachadh fhlùraichean (Fig. 11e a bharrachd). Chaidh RGL1 agus RGL3 mRNA a lorg air feadh canopy SAM agus ann am flùraichean nas sine, ach bha RGL2 mRNA nas pailte ann an roinn na crìche (Fig. 11f–h a bharrachd). Ìomhaighean confocal de pRGL3:: Dhearbh RGL3-GFP SAM an abairt a chaidh fhaicinn le hybridization in situ agus sheall e gu bheil pròtain RGL3 a’ cruinneachadh ann am meadhan pàirt an SAM (Fig. 11i Leasachail). A’ cleachdadh loidhne pRGA ::GFP-RGA, lorg sinn cuideachd gu bheil pròtain RGA a’ cruinneachadh anns an SAM, ach tha am pailteas aige a’ dol sìos aig a’ chrìch a’ tòiseachadh bho P4 (Fig. 11j a bharrachd). Gu sònraichte, tha na pàtrain abairt RGL3 agus RGA co-chòrdail ri gnìomhachd comharran GA nas àirde san IPR, mar a chaidh a lorg le qmRGA (Fig. 4). A bharrachd air an sin, tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil a h-uile DELLA air an cur an cèill anns an SAM agus gu bheil an abairt aca còmhla a’ dol thairis air an SAM gu lèir.
Rinn sinn an uairsin mion-sgrùdadh air paramadairean roinn cealla anns na seòrsa fiadhaich SAM (Ler, smachd) agus na mutants gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (cruinneil) (Fig. 6a, b). Gu h-inntinneach, chunnaic sinn gluasad cudromach gu staitistigeil ann an cuairteachadh tricead ceàrn roinn cealla anns an della global mutant SAM an coimeas ris an t-seòrsa fiadhaich (Fig. 6c). Bha an t-atharrachadh seo anns an della cruinne mutant mar thoradh air àrdachadh ann an tricead ceàrnan 80–90 ° (34.71% vs. 24.55%) agus, gu ìre nas lugha, ceàrnan 70–80 ° (23.78% vs 20.18%), ie, a rèir roinnean cealla transverse (Fig. 6c). Bha tricead sgaraidhean neo-transverse (0-60 °) cuideachd nas ìsle anns an della mutant cruinne (Fig. 6c). Chaidh tricead sgaraidhean cealla transverse àrdachadh gu mòr anns an SAM den della global mutant (Fig. 6b). Bha tricead sgaraidhean cealla transverse san IPR cuideachd nas àirde anns an della mutant cruinne an coimeas ris an t-seòrsa fiadhaich (Fig. 6d). Taobh a-muigh na roinne IPR, bha cuairteachadh nas aona aig an t-seòrsa fiadhaich de cheàrnan roinneadh cealla, ach b’ fheàrr leis an della global mutant roinnean tangential mar an IPR (Fig. 6e). Rinn sinn cuideachd tomhas air stiùireadh roinnean cealla anns an SAM de quintuple mutants ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, agus ga2ox6-2), cùl-raon mutant GA-neo-ghnìomhach anns a bheil GA a’ cruinneachadh. Co-chòrdail ris an àrdachadh ann an ìrean GA, bha an SAM den quintuple ga2ox mutant inflorescence nas motha na an Col-0 (Fig. Leasachail 12a, b), agus an taca ri Col-0, sheall an còigeamh ga2ox SAM cuairteachadh gu tur eadar-dhealaichte de cheàrnan roinneadh cealla, le tricead ceàrn ag èirigh bho 50 ° gu 90 ° a-rithist roinneadh F. 12a–c). Mar sin, tha sinn a’ sealltainn gu bheil gnìomhachadh bun-reachdail de chomharran GA agus cruinneachadh GA ag adhbhrachadh sgaraidhean cealla taobhach san IPR agus sa chòrr den SAM.
a, b Ìomhaigh 3D den t-sreath L1 de Ler le dath PI (a) agus cruinne della mutant (b) SAM a’ cleachdadh microscopy confocal. Tha ballachan cealla ùra a chaidh a chruthachadh anns an SAM (ach chan e am primordium) thar ùine 10-h air an sealltainn agus air an dath a rèir an luachan ceàrn. Tha an inset a’ sealltainn an SAM aig 0 h. Tha am bàr dath air a thaisbeanadh san oisean gu h-ìosal air an làimh dheis. Tha an t-saighead ann an (b) a’ comharrachadh eisimpleir de fhaidhlichean cealla co-thaobhadh anns an cruinne della mutant. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean co-chosmhail. ce coimeas a dhèanamh eadar cuairteachadh tricead stiùiridhean plèana roinneadh cealla anns an SAM (d), IPR (e), agus neo-IPR (f) eadar Ler agus global della. Chaidh luachan P fhaighinn le bhith a’ cleachdadh deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earball. f, g Sealladh 3D air ìomhaighean confocal de SAM le dath PI de Col-0 (i) agus pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) planntaichean tar-ghnèitheach. Bidh pannalan (a, b) a’ sealltainn ballachan cealla ùra (ach chan e primordia) air an cruthachadh anns an SAM taobh a-staigh 10 h. Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair le toraidhean co-chosmhail. h–j Coimeas air cuairteachadh tricead stiùiridhean plèana roinn cealla a tha suidhichte anns an SAM (h), IPR (i) agus neo-IPR (j) eadar planntaichean Col-0 agus pCUC2::gai-1-VENUS. Chaidh luachan P fhaighinn le bhith a’ cleachdadh deuchainn Kolmogorov-Smirnov dà-earball.
An uairsin rinn sinn deuchainn air a’ bhuaidh a bhiodh aig bacadh air comharran GA gu sònraichte san IPR. Chun na crìche seo, chleachd sinn an neach-adhartachaidh cupa cotyledon 2 (CUC2) gus faireachdainn de phròtain gai-1 àicheil a chuir an sàs ann an VENUS (anns an loidhne pCUC2 :: gai-1-VENUS). Anns an seòrsa fiadhaich SAM, bidh an neach-adhartachaidh CUC2 a’ stiùireadh faireachdainn den mhòr-chuid de IPRn anns an SAM, a’ toirt a-steach ceallan crìche, bho P4 air adhart, agus chaidh faireachdainn sònraichte coltach ris a choimhead ann am pCUC2:: planntaichean gai-1-VENUS (faic gu h-ìosal). Cha robh cuairteachadh ceàrnan roinneadh cealla thairis air an SAM no IPR de pCUC2::gai-1-VENUS planntrais gu math eadar-dhealaichte bhon t-seòrsa fiadhaich, ged nach robh dùil lorg sinn gu robh ceallan gun IPR anns na lusan sin air an roinn aig tricead nas àirde de 80–90 ° (Fig. 6f–j).
Thathas air a ràdh gu bheil stiùireadh roinneadh cealla an urra ri geoimeatraidh an SAM, gu sònraichte an cuideam tensile a thig bhon lùbadh maothraidh46. Mar sin dh’ fhaighnich sinn an deach cruth an SAM atharrachadh anns na planntaichean della mutant global agus pCUC2 :: gai-1-VENUS. Mar a chaidh aithris roimhe12, bha meud an della global mutant SAM nas motha na an seòrsa fiadhaich (Fig. 13a, b, d). Dhaingnich tar-chòmhdachadh in situ de CLV3 agus STM RNA an leudachadh meristem ann an della mutants agus sheall e tuilleadh leudachadh taobhach de dh’ àite sònraichte bun-cheallan (Fig. 13e, f, h, i). Ach, bha an curvature SAM coltach ris an dà genotypes (Fig. 13k, m, n, p). Chunnaic sinn àrdachadh co-chosmhail ann am meud anns an mutant quadruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della gun atharrachadh ann an curvature an taca ris an t-seòrsa fiadhaich (Fig. Leasachail 13c, d, g, j, l, o, p). Bha buaidh cuideachd air tricead stiùireadh roinn cealla anns an della ceithir-cheàrnach mutant, ach gu ìre nas lugha na anns an della monolithic mutant (Fig. 12d – f a bharrachd). Tha a’ bhuaidh dosachaidh seo, còmhla ri dìth buaidh air curvature, a’ moladh gu bheil gnìomhachd RGL3 air fhàgail ann an ceithir-cheàrnach Della mutant a’ cuingealachadh atharrachaidhean ann an stiùireadh roinn cealla air adhbhrachadh le call gnìomhachd DELLA agus gu bheil atharrachaidhean ann an roinnean cealla taobhach a’ tachairt mar fhreagairt air atharrachaidhean ann an gnìomhachd comharran GA seach atharrachaidhean ann an geoimeatraidh SAM. Mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, bidh an neach-adhartachaidh CUC2 a’ stiùireadh abairt IPR anns an SAM a’ tòiseachadh aig P4 (Fig. Leasachail 14a, b), agus an coimeas ri sin, bha meud nas lugha aig am pCUC2:: gai-1-VENUS SAM ach curvature nas àirde (Fig. Leasachail 14c–h). Dh’ fhaodadh an t-atharrachadh seo ann am morf-eòlas pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM leantainn gu cuairteachadh eadar-dhealaichte de chuideaman meacanaigeach an taca ris an t-seòrsa fiadhaich, anns am bi cuideaman cuairteachaidh àrd a’ tòiseachadh aig astar nas giorra bhon ionad SAM47. Air an làimh eile, faodaidh na h-atharrachaidhean ann am morf-eòlas pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM a bhith mar thoradh air atharrachaidhean ann an feartan meacanaigeach roinneil air adhbhrachadh le abairt transgene48. Anns gach cùis, dh’ fhaodadh seo cuid de bhuaidhean atharrachaidhean ann an comharran GA a chothromachadh le bhith a’ meudachadh an coltas gum bi ceallan a’ roinn anns an t-slighe circumferential/transverse, a’ mìneachadh ar beachdan.
Air an gabhail còmhla, tha an dàta againn a’ dearbhadh gu bheil pàirt gnìomhach aig comharran GA nas àirde ann an stiùireadh taobhach plèana roinn cealla san IPR. Tha iad cuideachd a 'sealltainn gu bheil curvature meristem cuideachd a' toirt buaidh air stiùireadh a 'phlèana roinn cealla san IPR.
Tha stiùireadh transverse an itealain roinne san IPR, mar thoradh air gnìomhachd comharran GA àrd, a’ moladh gum bi GA a’ ro-eagrachadh faidhle cealla radial anns an epidermis taobh a-staigh an SAM gus am buidheann ceallach a lorgar nas fhaide air adhart anns an internode epidermal a mhìneachadh. Gu dearbh, bha faidhlichean cealla mar sin rim faicinn gu tric ann an ìomhaighean SAM de della mutants cruinne (Fig. 6b). Mar sin, gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air obair leasachaidh pàtran spàsail comharran GA anns an SAM, chleachd sinn ìomhaighean ùine-tìm gus sgrùdadh a dhèanamh air eagrachadh spàsail cheallan anns an IPR ann an seòrsa fiadhaich (Ler agus Col-0), della mutants cruinne, agus pCUC2:: planntaichean tar-ghnèitheach gai-1-VENUS.
Fhuair sinn a-mach gun do sheall qmRGA gun robh gnìomhachd chomharran GA anns an IPR a’ dol suas bho P1/P2 agus aig àirde P4, agus dh’ fhan am pàtran seo seasmhach thar ùine (Fig. 4a–f agus Fig. 8c–f, k). Gus sgrùdadh a dhèanamh air eagrachadh spàsail cheallan anns an IPR le comharra GA a bha a’ sìor fhàs, chuir sinn bileagan Ler IPR gu h-àrd agus gu taobhan P4 a rèir an dàn leasachaidh a chaidh a sgrùdadh 34 h às deidh a’ chiad amharc, ie, barrachd air dà uair plastid, a’ leigeil leinn ceallan IPR a leantainn rè leasachadh primordium bho P1 / P2 gu P4. Chleachd sinn trì dathan eadar-dhealaichte: buidhe airson nan ceallan sin a chaidh am filleadh a-steach don primordium faisg air P4, uaine dhaibhsan a bha san IPR, agus purpaidh dhaibhsan a ghabh pàirt anns an dà phròiseas (Fig. 7a–c). Aig t0 (0 h), bha sreathan 1-2 de cheallan IPR rim faicinn air beulaibh P4 (Fig. 7a). Mar a bhiodh dùil, nuair a roinneadh na ceallan sin, rinn iad sin sa mhòr-chuid tron phlèana tar-roinn (Figs. 7a–c). Chaidh toraidhean co-chosmhail fhaighinn le bhith a’ cleachdadh Col-0 SAM (le fòcas air P3, aig a bheil a chrìochan a’ pasgadh coltach ri P4 ann an Ler), ged a bha am filleadh a chaidh a chruthachadh aig a’ chrìoch fhlùraichean a’ falach nan ceallan IPR na bu luaithe anns an genotype seo (Fig. 7g–i). Mar sin, bidh pàtran roinneadh cheallan IPR a’ ro-eagrachadh nan ceallan gu sreathan radial, mar ann an internodes. Tha eagrachadh sreathan radial agus sgìreachadh cheallan IPR eadar buill-bodhaig leantainneach a’ moladh gu bheil na ceallan sin nan luchd-adhartachaidh eadar-roinneil.
An seo, leasaich sinn biosensor comharradh GA reusanta, qmRGA, a leigeas le mapadh cainneachdail de ghnìomhachd comharran GA mar thoradh air co-chruinneachaidhean gabhadan GA agus GA fhad ‘s a tha sinn a’ lughdachadh casg air slighean comharran endogenous, agus mar sin a ’toirt seachad fiosrachadh mu ghnìomhachd GA aig an ìre cealla. Chun na crìche seo, thog sinn pròtain DELLA atharraichte, mRGA, a chaill an comas com-pàirtichean eadar-obrachaidh DELLA a cheangal ach a tha fhathast mothachail air proteolysis air a bhrosnachadh le GA. Bidh qmRGA a’ freagairt gach cuid atharrachaidhean exogenous agus endogenous ann an ìrean GA, agus tha na feartan mothachaidh fiùghantach aige a’ comasachadh measadh air atharrachaidhean spatiotemporal ann an gnìomhachd comharran GA rè leasachadh. Tha qmRGA cuideachd na inneal gu math sùbailte oir faodar atharrachadh gu diofar fhigheagan le bhith ag atharrachadh an neach-adhartachaidh a thathar a’ cleachdadh airson a chuir an cèill (ma tha sin riatanach), agus leis cho glèidhte sa tha slighe chomharran GA agus motif PFYRE thairis air angiosperms, tha coltas ann gum bi e comasach a ghluasad gu gnèithean eile22. Co-chòrdail ri seo, chaidh sealltainn gu robh mùthadh co-ionann ann am pròtain rus SLR1 DELLA (HYY497AAA) cuideachd a’ cuir stad air gnìomhachd ath-bhualadh fàis SLR1 fhad ‘s nach robh e ach beagan a’ lughdachadh an ìsleachadh meadhan-GA aige, coltach ri mRGA23. Gu sònraichte, sheall sgrùdaidhean o chionn ghoirid ann an Arabidopsis gun do dh’ atharraich aon mhùthadh aminoideach ann an raon PFYRE (S474L) gnìomhachd tar-sgrìobhaidh RGA gun a bhith a’ toirt buaidh air a chomas eadar-obrachadh le com-pàirtichean factar tar-sgrìobhaidh50. Ged a tha am mùthadh seo gu math faisg air na 3 ionadan aminoideach a tha an làthair ann am mRGA, tha na sgrùdaidhean againn a’ sealltainn gu bheil an dà mhùthadh sin ag atharrachadh feartan sònraichte DELLA. Ged a tha a’ mhòr-chuid de chom-pàirtichean factar tar-sgrìobhaidh a’ ceangal ri raointean LHR1 agus SAW de DELLA26,51, dh’ fhaodadh cuid de amino-aigéid glèidhte ann an raon PFYRE cuideachadh gus na h-eadar-obrachaidhean sin a dhèanamh seasmhach.
Tha leasachadh internode na phrìomh fheart ann an ailtireachd planntrais agus leasachadh toraidh. Nochd qmRGA gnìomhachd comharran GA nas àirde ann an ceallan progenitor internode IPR. Le bhith a’ cothlamadh ìomhaighean cainneachdail agus gintinneachd, sheall sinn gu bheil pàtrain comharran GA a’ cuir thairis plèanaichean roinneadh cealla cruinn / transverse anns an epidermis SAM, a’ cumadh a’ bhuidheann roinn cealla a tha riatanach airson leasachadh internode. Chaidh grunn riaghladairean air stiùireadh plèana roinneadh cealla a chomharrachadh rè leasachadh52,53. Tha ar n-obair a’ toirt seachad eisimpleir shoilleir air mar a bhios gnìomhachd comharran GA a’ riaghladh a’ pharameter ceallach seo. Faodaidh DELLA eadar-obrachadh le iom-fhilltean pròtain ro-fhillte41, agus mar sin faodaidh comharran GA stiùireadh plèana roinneadh cealla a riaghladh le bhith a’ toirt buaidh dhìreach air stiùireadh cortical microtubule40,41,54,55. Sheall sinn gun dùil, ann an SAM, nach e leudachadh cealla no roinneadh a bh’ ann an co-dhàimh gnìomhachd comharran GA nas àirde, ach dìreach anisotropy fàis, a tha co-chòrdail ri buaidh dhìreach GA air stiùir roinneadh cealla san IPR. Ach, chan urrainn dhuinn cumail a-mach gum faodadh a’ bhuaidh seo a bhith neo-dhìreach cuideachd, mar eisimpleir air a mheadhanachadh le bhith a’ bogachadh balla cealla air a bhrosnachadh le GA56. Bidh atharrachaidhean ann an togalaichean balla cealla ag adhbhrachadh cuideam meacanaigeach57,58, a dh’ fhaodadh buaidh a thoirt cuideachd air stiùireadh plèana roinn cealla le bhith a’ toirt buaidh air stiùireadh microtubules cortical39,46,59. Dh’ fhaodadh na buaidhean co-cheangailte ri cuideam meacanaigeach air a bhrosnachadh le GA agus riaghladh dìreach air stiùireadh microtubule le GA a bhith an sàs ann a bhith a’ gineadh pàtran sònraichte de stiùireadh roinn cealla anns an IPR gus internodes a mhìneachadh, agus tha feum air tuilleadh sgrùdaidhean gus am beachd seo a dhearbhadh. San aon dòigh, tha sgrùdaidhean roimhe air cuideam a chuir air pròtainean eadar-ghnìomhach DELLA TCP14 agus 15 ann an smachd cruthachadh internode60,61 agus dh’ fhaodadh na factaran sin gnìomhachd GA a mheadhanachadh còmhla ri BREVIPEDICELLUS (BP) agus PENNYWISE (PNY), a bhios a’ riaghladh leasachadh internode agus a chaidh a dhearbhadh gu bheil buaidh aca air comharran GA2,62. Leis gu bheil DELLAn ag eadar-obrachadh le brassinosteroid, ethylene, searbhag jasmonic, agus searbhag abscisic (ABA) a’ comharrachadh slighean63,64 agus gum faod na h-hormonaichean sin buaidh a thoirt air stiùireadh microtubule65, dh’ fhaodadh buaidh GA air stiùireadh roinn cealla a bhith air a mheadhanachadh le hormonaichean eile.
Sheall sgrùdaidhean tràth eòlas-inntinn gu bheil feum air gach cuid na roinnean a-staigh agus a-muigh den Arabidopsis SAM airson leasachadh internode2,42. Tha an fhìrinn gu bheil GA gu gnìomhach a’ riaghladh roinneadh cealla anns na figheagan a-staigh12 a’ toirt taic do dhleastanas dùbailte GA ann a bhith a’ riaghladh meud meristem agus internode anns an SAM. Tha am pàtran de roinn cealla stiùiridh cuideachd air a riaghladh gu teann ann an clò SAM a-staigh, agus tha an riaghladh seo deatamach airson fàs gas52. Bidh e inntinneach sgrùdadh a dhèanamh a bheil pàirt aig GA cuideachd ann a bhith a’ stiùireadh an itealan roinn cealla anns a’ bhuidheann SAM a-staigh, agus mar sin a’ sioncronadh sònrachadh agus leasachadh internodes taobh a-staigh an SAM.
Chaidh planntrais fhàs ann an vitro ann an ùir no meadhan 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) le taic bho 1% sucrose agus 1% agar (Sigma) fo chumhachan àbhaisteach (solas 16 h, 22 ° C), ach a-mhàin deuchainnean hypocotyl agus fàs freumh anns an deach sìolaidhean fhàs air lannan dìreach fo sholas seasmhach agus 22 ° C. Airson deuchainnean nitrate, chaidh planntrais fhàs air MS meadhan atharraichte (meadhan planntrais bioWORLD) le taic bho nitrate iomchaidh (0 no 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose agus 1% A-agar (Sigma) fo chumhachan fad-latha.
Chaidh GID1a cDNA a chuir a-steach do pDONR221 ath-chur còmhla le pDONR P4-P1R-pUBQ10 agus pDONR P2R-P3-mCherry a-steach do pB7m34GW gus pUBQ10 :: GID1a-mCherry a ghineadh. Chaidh IDD2 DNA a chuir a-steach do pDONR221 ath-chur còmhla ann am pB7RWG266 gus p35S: IDD2-RFP a ghineadh. Gus pGID1b a ghineadh::: 2xmTQ2-GID1b, chaidh criomag 3.9 kb shuas an abhainn de roinn còdaidh GID1b agus criomag 4.7 kb anns an robh an GID1b cDNA (1.3 kb) agus inneal-crìochnachaidh (3.4 kb) a mheudachadh an toiseach le bhith a’ cleachdadh na primers ann an Clàr Leasachail 3 agus an uairsin cuir a-steach PDONNRcient-Iasgair a-steach gu Clàr Leasachail 3 agus an uairsin cuir a-steach PDONNRcientmo ann an Clàr Leasachail. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), fa leth, agus mu dheireadh air ath-chur còmhla le pDONR221 2xmTQ268 a-steach don vectar targaid pGreen 012567 a’ cleachdadh clonadh Gateway. Gus pCUC2 a ghineadh :: LSSmOrange, chaidh an t-sreath adhartachaidh CUC2 (3229 bp suas an abhainn bho ATG) agus an uairsin an t-sreath còdaidh de mOrange mòr a chaidh a ghluasad le Stokes (LSSmOrange)69 le comharra sgìreachadh niùclasach N7 agus inneal-crìochnachaidh tar-sgrìobhaidh NOS a chruinneachadh a-steach don pGreen kanamycin ag amas air vectar ion-chuimseach3fra a’ cleachdadh siostam ath-chuairteachaidh Gateway. Chaidh an vectar binary planntrais a thoirt a-steach do Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 agus a thoirt a-steach do dhuilleagan Nicotiana benthamiana le modh in-shìoladh Agrobacterium agus a-steach do Arabidopsis thaliana Col-0 le modh dip fhlùraichean, fa leth. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry agus pCLV3 :: mCherry-NLS Chaidh qmRGA a sgaradh bho shliochd F3 agus F1 nan croisean fa leth, fa leth.
Chaidh tar-chur RNA in situ a dhèanamh air timcheall air 1 cm molaidhean seilg fada72, a chaidh a chruinneachadh agus a shuidheachadh sa bhad ann am fuasgladh FAA (3.7% formaldehyde, 5% searbhag acetic, 50% ethanol) ro-fhuarachadh gu 4 ° C. Às deidh làimhseachadh falamh 2 × 15 min, chaidh an fixative atharrachadh agus chaidh sampallan a bhrosnachadh thar oidhche. Chaidh GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, agus RGL3 cDNAs agus probes antisense gu na 3 ′-UTR aca a cho-chur a’ cleachdadh na primers a chithear ann an Clàr Leasachail 3 mar a chaidh a mhìneachadh le Rosier et al.73. Chaidh probes le bileagan digoxigenin a lorg le bhith a’ cleachdadh antibodies digoxigenin (lagachadh 3000-fold; Roche, àireamh catalog: 11 093 274 910), agus chaidh earrannan a dhath le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fold dilution) / BTtrozni fold tetra-fold, 250-fold tetra-fold. caolachadh) fuasgladh.
Ùine puist: 10-10/2025