An droga anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEETChaidh aithris gu bheil ) a’ cur bacadh air AChE (acetylcholinesterase) agus gu bheil feartan carcinogenic aige air sgàth cus vascularization. Anns a’ phàipear seo, tha sinn a’ sealltainn gu bheil DEET gu sònraichte a’ brosnachadh cheallan endothelial a bhios a’ brosnachadh angiogenesis, agus mar sin a’ meudachadh fàs tumhair. Bidh DEET a’ gnìomhachadh phròiseasan ceallach a tha a’ leantainn gu angiogenesis, a’ gabhail a-steach iomadachadh, imrich, agus greamachadh. Tha seo co-cheangailte ri barrachd cinneasachadh NO agus abairt VEGF ann an ceallan endothelial. Chuir cuir às do M3 no cleachdadh luchd-bacadh cungaidh-leigheis M3 às do na buaidhean sin uile, a’ moladh gu bheil angiogenesis air adhbhrachadh le DEET mothachail air M3. Tha deuchainnean anns a bheil comharran calcium ann an ceallan endothelial agus HEK a tha a’ cur cus-chur an cèill gabhadan M3, a bharrachd air sgrùdaidhean ceangail agus docaidh, a’ nochdadh gu bheil DEET ag obair mar moduladair allosteric de gabhadan M3. A bharrachd air an sin, bidh DEET a’ cur bacadh air AChE, agus mar sin a’ meudachadh bith-ruigsinneachd acetylcholine agus a cheangal ri gabhadan M3, agus a’ neartachadh buaidhean proangiogenic tro riaghladh allosteric.
Chaidh ECan bun-sgoile a sgaradh bho aorta luchagan Eilbheiseach. Chaidh an dòigh às-tharraing atharrachadh bhon phròtacal Kobayashi 26. Chaidh ECan luchag a chultarachadh ann am meadhan EBM-2 le 5% FBS neo-ghnìomhach teas air a chur ris gus an ceathramh pas.
Chaidh buaidh dà cho-chruinneachadh de DEET air iomadachadh HUVEC, U87MG, no BF16F10 a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh Pasgan Deuchainn Iomadachadh Cealla CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Gu h-aithghearr, chaidh 5.103 ceallan gach tobar a chur ann am plàta 96-tobar, leigte leotha ceangal thar oidhche, agus an uairsin chaidh an làimhseachadh le DEET airson 24 uair a thìde. Às deidh dhut am meadhan fàis a thoirt air falbh, cuir fuasgladh ceangail datha ri gach tobar den mhicro-phlàta agus goir na ceallan aig 37 °C airson 30 mionaid. Chaidh ìrean fluorescence a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh leughadair micro-phlàta ioma-mhodh Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, a’ Ghearmailt) uidheamaichte le sìoltachain brosnachaidh 485 nm agus sìoltachain sgaoilidh 530 nm.
Chaidh HUVEC a chur ann am pleitean 96-tobar aig dùmhlachd de 104 cealla gach tobar. Chaidh na ceallan a làimhseachadh le DEET airson 24 uair a thìde. Chaidh comas-beò cealla a mheasadh le bhith a’ cleachdadh deuchainn MTT dath-mheudrach (Sigma-Aldrich, M5655). Fhuaireadh luachan dùmhlachd optigeach air leughadair meanbh-phlàtaichean ioma-mhodh (Mithras LB940) aig tonn-fhaid de 570 nm.
Chaidh buaidhean DEET a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh deuchainnean angiogenesis in vitro. Mheudaich làimhseachadh le 10-8 M no 10-5 M DEET cruthachadh fad capillary ann an HUVECan (Figear 1a, b, bàraichean geala). An coimeas ris a’ bhuidheann smachd, sheall làimhseachadh le dùmhlachdan DEET eadar 10-14 agus 10-5 M gun do ràinig fad na capillary àrdchlàr aig 10-8 M DEET (Figear a bharrachd S2). Cha deach eadar-dhealachadh mòr sam bith a lorg ann am buaidh proangiogenic in vitro HUVECan a chaidh a làimhseachadh le DEET anns an raon dùmhlachd 10-8 M agus 10-5 M.
Gus buaidh DEET air neo-vascularization a dhearbhadh, rinn sinn sgrùdaidhean neo-vascularization in vivo. Às dèidh 14 latha, sheall luchagan air an robh ceallan endothelial air an ro-chultarachadh le 10-8 M no 10-5 M DEET àrdachadh mòr ann an susbaint haemoglobin (Figear 1c, bàraichean geala).
A bharrachd air an sin, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air neovascularization air adhbhrachadh le DEET ann an luchagan le xenograft U87MG a chaidh a stealladh gach latha (ip) le DEET aig dòs a tha aithnichte airson dùmhlachdan plasma de 10-5 M adhbhrachadh, rud a tha àbhaisteach ann an daoine a chaidh a nochdadh. ann an 23. Chaidh tumhair a ghabhas lorg (ie tumhair >100 mm3) fhaicinn 14 latha às deidh stealladh cheallan U87MG a-steach do luchagan. Aig latha 28, bha fàs tumhair air a neartachadh gu mòr ann an luchagan air an làimhseachadh le DEET an taca ri luchagan smachd (Figear 1d, ceàrnagan). A bharrachd air an sin, sheall dathadh CD31 de tumhair gun do mheudaich DEET farsaingeachd capillary gu mòr ach chan e dùmhlachd meanbh-shoithichean. (Figear 1e–g).
Gus àite gabhadan muscarinic ann am iomadachadh air adhbhrachadh le DETA a dhearbhadh, chaidh 10-8 M no 10-5 M DETA a chleachdadh ann an làthair pFHHSiD (10-7 M, antagonist gabhadair M3 roghnach). Làimhseachadh HUVEC. Chuir pFHHSiD bacadh gu tur air feartan iomadachaidh DETA aig a h-uile dùmhlachd (Clàr 1).
Fo na cumhaichean seo, rinn sinn sgrùdadh cuideachd an àrdaicheadh DEET fad na capillary ann an ceallan HUVEC. San aon dòigh, chuir pFHHSiD casg mòr air fad na capillary air adhbhrachadh le DEET (Figear 1a, b, bàraichean liatha). A bharrachd air an sin, chaidh deuchainnean coltach ris a dhèanamh le M3 siRNA. Ged nach robh an siRNA smachd èifeachdach ann a bhith a’ brosnachadh cruthachadh capillary, chuir sàmhchair an gabhadair muscarinic M3 às do chomas DEET fad na capillary a mheudachadh (Figear 1a, b, bàraichean dubha).
A bharrachd air sin, chaidh an dà chuid soithichean fala a chaidh a bhrosnachadh le DEET 10-8 M no 10-5 M a bhacadh gu tur le pFHHSiD (Figear 1c, d, cearcallan). Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gu bheil DEET a’ brosnachadh angiogenesis tro shlighe a tha mothachail air luchd-bacadh gabhadair M3 roghnach no M3 siRNA.
’S e AChE an targaid mhóileciuil aig DEET. Faodaidh drogaichean leithid donepezil, a bhios ag obair mar luchd-bacadh AChE, angiogenesis EC a bhrosnachadh in vitro agus ann am modalan ischemia deiridh luchaige14. Rinn sinn deuchainn air buaidh dà cho-chruinneachadh de DEET air gnìomhachd einnsein AChE ann an HUVEC. Lùghdaich co-chruinneachaidhean ìosal (10-8 M) agus àrd (10-5 M) de DEET gnìomhachd endothelial AChE an taca ri suidheachaidhean smachd (Figear 2).
Lùghdaich an dà cho-chruinneachadh de DEET (10-8 M agus 10-5 M) gnìomhachd acetylcholinesterase air HUVEC. Chaidh BW284c51 (10-5 M) a chleachdadh mar smachd airson luchd-bacadh acetylcholinesterase. Tha na toraidhean air an cur an cèill mar cheudad de ghnìomhachd AChE air HUVEC air a làimhseachadh leis an dà cho-chruinneachadh de DEET an taca ri ceallan air an làimhseachadh le carbad. Tha luachan air an cur an cèill mar chuibheasachd ± SEM de shia deuchainnean neo-eisimeileach. *p < 0.05 an taca ris a’ smachd (deuchainn coimeas ioma-fhillte Kruskal-Wallis agus Dunn).
Tha nitric oxide (NO) an sàs anns a’ phròiseas angiogenic 33, mar sin, chaidh cinneasachadh NO ann an HUVECan air an brosnachadh le DEET a sgrùdadh. Chaidh cinneasachadh NO endothelial air a làimhseachadh le DEET a mheudachadh an taca ri ceallan smachd, ach ràinig e cudromachd aig dòs de 10-8 M a-mhàin (Figear 3c). Gus na h-atharrachaidhean moileciuil a tha a’ cumail smachd air cinneasachadh NO air adhbhrachadh le DEET a dhearbhadh, chaidh abairt agus gnìomhachadh eNOS a sgrùdadh le Western blotting. Ged nach do dh’ atharraich làimhseachadh DEET abairt eNOS, mheudaich e gu mòr fosfaireachadh eNOS aig an làrach gnìomhachaidh aige (Ser-1177) fhad ‘s a bha e a’ lughdachadh an làraich bacaidh aige (Thr-495) an taca ri ceallan gun làimhseachadh ann am fosfaireachadh eNOS (Figear 3d). A bharrachd air an sin, chaidh an co-mheas de eNOS fosfairichte aig an làrach gnìomhachaidh agus an làrach bacaidh obrachadh a-mach às deidh an ìre de eNOS fosfairichte a dhèanamh àbhaisteach ri meud iomlan an einnsein. Chaidh an co-mheas seo a mheudachadh gu mòr ann an HUVECan air an làimhseachadh le gach dùmhlachd de DEET an taca ri ceallan gun làimhseachadh (Figear 3d).
Mu dheireadh, chaidh an ìre de VEGF, aon de na prìomh nithean pro-angiogenic, a sgrùdadh le Western blotting. Mheudaich DEET an ìre de VEGF gu mòr, ach chuir pFHHSiD bacadh air an ìre seo gu tur.
Leis gu bheil buaidhean DEET mothachail air bacadh cungaidh-leigheis agus lùghdachadh gabhadairean M3, rinn sinn deuchainn air a’ bharail gum faodadh DEET comharran calcium a neartachadh. Gu iongantach, cha do shoirbhich le DEET calcium siotoplasmach a mheudachadh ann an HUVEC (dàta gun a shealltainn) agus HEK/M3 (Figear 4a, b) airson an dà cho-chruinneachadh a chaidh a chleachdadh.
Àm puist: 30 Dùbhlachd 2024