An droga anthelmintic N, N-diethyl-m-toluamide (DEET) air aithris gun cuir e bacadh air AChE (acetylcholinesterase) agus gu bheil feartan carcinogenic aige mar thoradh air cus vascularization. Anns a’ phàipear seo, tha sinn a’ sealltainn gu bheil DEET gu sònraichte a’ brosnachadh cheallan endothelial a bhrosnaicheas angiogenesis, agus mar sin a’ meudachadh fàs tumhair. Bidh DEET a’ gnìomhachadh phròiseasan ceallach a tha a’ leantainn gu angiogenesis, a’ gabhail a-steach iomadachadh, imrich, agus greimeachadh. Tha seo co-cheangailte ri barrachd cinneasachadh NO agus abairt VEGF ann an ceallan endothelial. Chuir sàmhchair M3 no cleachdadh luchd-bacadh cungaidh-leigheis M3 às do na buaidhean sin uile, a’ moladh gu bheil angiogenesis air a bhrosnachadh le DEET mothachail air M3. Tha deuchainnean a’ toirt a-steach comharran calcium ann an ceallan endothelial agus HEK a’ toirt cus cuideam air gabhadairean M3, a bharrachd air sgrùdaidhean ceangail is doca, a’ nochdadh gu bheil DEET ag obair mar mhoduladair allosteric de luchd-gabhail M3. A bharrachd air an sin, tha DEET a’ cur bacadh air AChE, agus mar sin a’ meudachadh bith-ruigsinneachd acetylcholine agus a cheangal ri gabhadairean M3, agus ag àrdachadh buaidhean proangiogenic tro riaghladh allosteric.
Bha ECan bun-sgoile air an sgaradh bho aorta luchagan na h-Eilbheis. Chaidh an dòigh às-tharraing atharrachadh bho phròtacal Kobayashi 26 . Chaidh Murine ECs a chultarachadh ann am meadhan EBM-2 le taic bho 5% le FBS gun teas gus an ceathramh trannsa.
Chaidh a’ bhuaidh a bh’ aig dà chruinneachadh de DEET air iomadachadh HUVEC, U87MG, no BF16F10 a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh an CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Ann an ùine ghoirid, chaidh ceallan 5.103 gach tobar a shìolachadh ann am plàta 96-tobar, cead a cheangal thar oidhche, agus an uairsin a làimhseachadh le DEET airson 24 h. Às deidh dhut am meadhan fàis a thoirt air falbh, cuir fuasgladh ceangail dath air gach tobar den mhicroplate agus thoir na ceallan gu 37 ° C airson 30 mionaid. Chaidh ìrean fluorescence a dhearbhadh le bhith a ’cleachdadh leughadair microplate ioma-mhodh Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, a’ Ghearmailt) uidheamaichte le sìoltachain excitation 485 nm agus sìoltachain sgaoilidh 530 nm.
Chaidh HUVEC a shìolachadh ann am pleitean 96-tobar aig dùmhlachd de cheallan 104 gach tobar. Chaidh ceallan a làimhseachadh le DEET airson 24 h. Chaidh comas obrachaidh cealla a mheasadh le bhith a’ cleachdadh assay MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). Chaidh luachan dùmhlachd optigeach fhaighinn air leughadair microplate multimode (Mithras LB940) aig tonn-tonn de 570 nm.
Chaidh buaidhean DEET a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh mheasaidhean angiogenesis in vitro. Le làimhseachadh le 10-8 M no 10-5 M DEET mheudaich cruthachadh fad capillary ann an HUVECs (Fig. 1a, b, bàraichean geala). An coimeas ris a 'bhuidheann smachd, sheall làimhseachadh le co-chruinneachaidhean DEET eadar 10-14 agus 10-5 M gun do ràinig an fhad capillary àrdchlàr aig 10-8 M DEET (Fig. S2 a bharrachd). Cha deach eadar-dhealachadh mòr sam bith a lorg anns a’ bhuaidh proangiogenic in vitro de HUVECn air an làimhseachadh le DEET anns an raon dùmhlachd de 10-8 M agus 10-5 M.
Gus buaidh DEET air neovascularization a dhearbhadh, rinn sinn ann an sgrùdaidhean neovascularization vivo. Às deidh 14 latha, nochd luchagan a chaidh an stealladh le ceallan endothelial preculture le 10-8 M no 10-5 M DEET àrdachadh mòr ann an susbaint hemoglobin (Fig. 1c, bàraichean geal).
A bharrachd air an sin, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air neovascularization air a bhrosnachadh le DEET ann an luchagan le xenograft U87MG a chaidh a chuir a-steach gach latha (ip) le DEET aig dòs ris an canar co-chruinneachaidhean plasma de 10-5 M, a tha àbhaisteach ann an daoine fosgailte. ann an 23. Chaidh tumors a lorgar (ie tumhair > 100 mm3) fhaicinn 14 latha às deidh ceallan U87MG a thoirt a-steach do luchainn. Aig latha 28, chaidh fàs tumhair àrdachadh gu mòr ann an luchagan air an làimhseachadh le DEET an coimeas ri luchagan smachd (Fig. 1d, ceàrnagan). A bharrachd air an sin, sheall staining CD31 de thumhair gun do mheudaich DEET gu mòr an raon capillary ach chan e dùmhlachd microvessel. (Fig. 1e–g).
Gus faighinn a-mach dè an àite a tha aig gabhadairean muscarinic ann an iomadachadh air a bhrosnachadh le DETA, chaidh 10-8 M no 10-5 M DETA an làthair pFHHSiD (10-7 M, antagonist receptor M3 roghnach) a chleachdadh. Làimhseachadh HUVEC. Chuir pFHHSiD bacadh gu tur air feartan iomadach DETA aig a h-uile dùmhlachd (Clàr 1).
Fo na cumhaichean sin, rinn sinn sgrùdadh cuideachd an toireadh DEET àrdachadh air fad capillary ann an ceallan HUVEC. San aon dòigh, chuir pFHHSiD bacadh mòr air fad capillary air a bhrosnachadh le DEET (Fig. 1a, b, bàraichean glasa). A bharrachd air an sin, chaidh deuchainnean coltach ris a dhèanamh le M3 siRNA. Ged nach robh an siRNA smachd èifeachdach ann a bhith a 'brosnachadh cruthachadh capillary, chuir sàmhchair an receptor muscarinic M3 às do chomas DEET gus fad capillary a mheudachadh (Fig. 1a, b, bàraichean dubha).
A bharrachd air an sin, chaidh an dà chuid vascularization 10-8 M no 10-5 M DEET-in vitro agus neovascularization in vivo a bhacadh gu tur le pFHHSiD (Fig. 1c, d, cearcallan). Tha na co-dhùnaidhean sin a’ nochdadh gu bheil DEET a’ brosnachadh angiogenesis tro shlighe a tha mothachail air antagonists receptor M3 roghnach no M3 siRNA.
Is e AChE targaid moileciuil DEET. Faodaidh drogaichean leithid donepezil, a tha ag obair mar luchd-dìon AChE, angiogenesis EC a bhrosnachadh in vitro agus ann am modalan ischemia hindlimb lucha14. Rinn sinn deuchainn air buaidh dà chruinneachadh de DEET air gnìomhachd enzyme AChE ann an HUVEC. Lùghdaich dùmhlachd ìosal (10-8 M) agus àrd (10-5 M) de DEET gnìomhachd AChE endothelial an coimeas ri suidheachaidhean smachd (Fig. 2).
Lùghdaich an dà chruinneachadh de DEET (10-8 M agus 10-5 M) gnìomhachd acetylcholinesterase air HUVEC. Chaidh BW284c51 (10-5 M) a chleachdadh mar smachd airson luchd-bacadh acetylcholinesterase. Tha toraidhean air an cur an cèill mar cheudad de ghnìomhachd AChE air HUVEC air a làimhseachadh leis an dà chruinneachadh de DEET an coimeas ri ceallan air an làimhseachadh le carbadan. Tha luachan air an cur an cèill mar mheadhan ± SEM de shia deuchainnean neo-eisimeileach. * p <0.05 an coimeas ri smachd (deuchainn coimeas ioma-Kruskal-Wallis agus Dunn).
Tha nitric oxide (NO) an sàs ann am pròiseas angiogenic 33, mar sin, cha deach sgrùdadh a dhèanamh air cinneasachadh ann an HUVECs air a bhrosnachadh le DEET. Chaidh cinneasachadh endothelial NO air a làimhseachadh le DEET a mheudachadh an coimeas ri ceallan smachd, ach cha do ràinig e brìgh ach aig dòs de 10-8 M (Fig. 3c). Gus faighinn a-mach dè na h-atharrachaidhean moileciuil a tha a’ cumail smachd air cinneasachadh NO air a bhrosnachadh le DEET, chaidh abairt agus gnìomhachd eNOS a sgrùdadh le Western blotting. Ged nach do dh’ atharraich làimhseachadh DEET abairt eNOS, mheudaich e gu mòr fosphorylation eNOS aig an làrach gnìomhachaidh aige (Ser-1177) fhad ‘s a lughdaich e an làrach bacaidh aige (Thr-495) an coimeas ri ceallan gun làimhseachadh ann an eNOS phosphorylation (Fig. 3d). A bharrachd air an sin, chaidh an co-mheas de eNOS fosphorylated aig an làrach gnìomhachaidh agus làrach bacaidh a thomhas às deidh an ìre de eNOS fosphorylated a dhèanamh àbhaisteach don t-suim iomlan de enzyme. Chaidh an co-mheas seo àrdachadh gu mòr ann an HUVECn air an làimhseachadh le gach dùmhlachd de DEET an coimeas ri ceallan gun làimhseachadh (Fig. 3d).
Mu dheireadh, chaidh an abairt de VEGF, aon de na prìomh nithean proangiogenic, a sgrùdadh le blotting an Iar. Mheudaich DEET abairt VEGF gu mòr, ach chuir pFHHSiD stad air an abairt seo gu tur .
Leis gu bheil buaidhean DEET mothachail air gach cuid bacadh cungaidh-leigheis agus ìsleachadh air gabhadairean M3, rinn sinn deuchainn air a’ bheachd-bharail gum faodadh DEET comharran calcium a neartachadh. Gu h-iongantach, cha do shoirbhich le DEET calcium cytoplasmic àrdachadh ann an HUVEC (dàta nach deach a shealltainn) agus HEK/M3 (Fig. 4a, b) airson an dà cho-chruinneachadh a chaidh a chleachdadh.
Ùine puist: Dùbhlachd-30-2024