Tha pàirt chudromach aig puinnseanan-bhiastagan ann a bhith a’ dèiligeadh ri gainnead bìdh cruinneil agus a’ sabaid ghalaran daonna a tha air an giùlan le vectaran. Ach, tha feum èiginneach air lorg choimeasgaidhean ùra a tha ag amas air targaidean nach eil air an cleachdadh gu leòr air sgàth na trioblaid a tha a’ sìor fhàs a thaobh strì an aghaidh puinnseanan-bhiastagan. Faodaidh seanalan comas gabhadair sealach bhiastagan (TRPV) - Nanzhong (Nan) agus neo-ghnìomhach (Iav) - seanalan heterologach (Nan-Iav) a chruthachadh agus an suidheachadh ann am buill-bodhaig mechanosensory a bhios a’ meadhanachadh geotropism, èisteachd, agus proprioception ann am biastagan. Bidh cuid de phuinnseanan-bhiastagan, leithid aphidopyrrolidone (AP), ag amas air Nan-Iav tro dhòighean-obrach neo-aithnichte. Tha AP èifeachdach an aghaidh bhiastagan a bhios a’ tolladh-sùgh (hemipterans), a’ cur casg air biathadh le bhith a’ cur dragh air gnìomh nam filamentan. Chan urrainn dha AP ceangal ach ri Nan, ach chan urrainn ach do Nan-Iav eadar-obrachadh le agonists, a’ gabhail a-steach nicotinamide endogenous (NAM), agus mar sin a’ taisbeanadh gnìomhachd seanail. A dh’ aindeoin comas Nan-Iav mar thargaid puinnseanan-bhiastagan, chan eil mòran fiosrachaidh againn mu chruinneachadh a sheanail, làraichean ceangail riaghlaidh, agus riaghladh a tha an urra ri Ca2+, a’ cur bacadh air tuilleadh leasachaidh puinnseanan-bhiastagan. Anns an sgrùdadh seo, chaidh microscopaidh crio-electron a chleachdadh gus structar Nan-Iav a dhearbhadh ann am biastagan Hemiptera anns an staid gun calmodulin-ligand, a bharrachd air AP agus NAM aig crìoch àrainn cytoplasmic ath-aithris ankyrin (ARD). Gu iongantach, fhuair sinn a-mach gum faod am pròtain Nan fhèin pentamer a chruthachadh, a tha air a dhaingneachadh le eadar-obrachaidhean ARD air an stiùireadh le AP. Tha an sgrùdadh seo a’ nochdadh eadar-obrachaidhean moileciuil eadar meanbh-bhiastagan agus agonists agus Nan-Iav, a’ soilleireachadh cho cudromach sa tha ARD ann an gnìomh agus cruinneachadh seanalan, agus a’ sgrùdadh meacanism riaghladh Ca2+.
An aghaidh cùl-raon atharrachadh clìomaid cruinneil a tha a’ sìor fhàs nas miosa, tha tèarainteachd bìdh cruinneil a tha a’ crìonadh mar aon de na prìomh dhùbhlain san 21mh linn, le builean leantainneach air a’ chomann-shòisealta.1,2Tha aithisg Staid Tèarainteachd Bidhe is Beathachaidh san t-Saoghal 2023 (SOFI) aig Buidheann Slàinte na Cruinne a’ meas gu bheil timcheall air 2.33 billean neach air feadh an t-saoghail a’ fulang le mì-thèarainteachd bìdh meadhanach gu dona, duilgheadas a tha air a bhith ann o chionn fhada.3,4Gu mì-fhortanach, thathar a’ meas gu bheil timcheall air 20% gu 30% no barrachd de thoradh bàrr a’ call gach bliadhna ri plàighean agus pathogens, agus thathar an dùil gun cuir blàthachadh na cruinne ris an aghaidh plàighean agus so-leòntachd bàrr.4, 5, 6, 7, 8Tha leasachadh puinnseanan-bhiastagan deatamach chan ann a-mhàin gus bàrr a dhìon bho phlàighean agus sgaoileadh pathogens a tha air an giùlan le vectaran a lughdachadh, ach cuideachd gus cuir an-aghaidh ghalaran daonna a tha air an giùlan le vectaran leithid fiabhras dengue, malaria, agus galar Chagas, a tha a’ sìor fhàs an aghaidh puinnseanan-bhiastagan.5,9,10,11
Am measg nam prìomh thargaidean airson meanbh-bhiastagan neurotoxic, tha an sianal TRPV heterotetrameric Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) a’ riochdachadh clas de thargaidean meanbh-bhiastagan a chaidh a lorg anns an deich bliadhna a dh’ fhalbh a-mhàin, nam measg meanbh-bhiastagan a tha rim faighinn gu malairteach leithid imidacloprid agus pyraclostrobin.12,13,14'S e toradh a chaidh a leasachadh agus a mhalairteachadh o chionn ghoirid a th' anns a' phuinnsean-bhiastagan leth-shintéiseach aphidopyrrolifen (AP) agus 's e am prìomh phàirt dheth am puinnsean-bhiastagan gnìomhach Inscalis®, a cheanglas ri AP aig ìre gnìomhachd fo-nanomolar.15Tha puinnseanta geur ìosal aig AP do phoileanaichean, biastagan buannachdail, agus fàs-bheairtean eile nach eil ag amas orra, agus nuair a thèid a chleachdadh a rèir stiùiridhean an leubail, faodaidh e cuideam an aghaidh bhiastagan-bhiastagan eile a lughdachadh.16,17,18Tha Nan agus Iav air an sgaoileadh gu farsaing thar ghnèithean bhiastagan, chan eil iad air an co-chur an cèill ach ann an neurons gabhadair sìneadh corda nan antennae agus nan buill, agus tha iad deatamach airson èisteachd, mothachadh grabhataidh, agus proprioception.13,16,19,20,21,22Bidh AP, imidacloprid, agus pyraclostrobin a’ brosnachadh an iom-fhillte Nan-Iav tro dhòigh-obrach gun samhail, agus mu dheireadh a’ cur bacadh air tar-chur comharran proprioceptive.13,16,23Ann am biastagan a bhios a’ suirghe gu tolladh (hemipterans) leithid aphids agus cuileagan-geala, bidh call proprioception a’ cur bacadh air an comas biadhaidh, agus mu dheireadh a’ leantainn gu bàs.13,24Gu inntinneach, tha AP a’ nochdadh dlùth-cheangal àrd airson an iom-fhillte Nan-Iav agus dlùth-cheangal ìosal airson Nan leis fhèin. Bidh ceangal AP ri Nan-Iav ag adhbhrachadh sruth dealain, ach chan eil ceangal ri Nan leis fhèin a’ brosnachadh gnìomhachd seanail. Chan eil Iav fhèin a’ ceangal ri AP idir.16Tha seo a’ moladh gum faodadh Nan agus Iav ceangal ri chèile gus diofar cho-thàthaidhean seanail Nan-Iav a chruthachadh (me, le diofar cho-mheasan stoichiometric no diofar rèiteachaidhean taobh a-staigh an aon cho-mheas stoichiometric) no gum faodadh AP ceangal ri iomadh làrach. A bharrachd air an sin, bidh an agonist nàdarra nicotinamide (NAM) a’ ceangal ri Drosophila Nan-Iav le dàimh micromolar, a’ nochdadh buaidhean coltach ri buaidhean aphids (AP) in vitro.16,25agus a’ cur bacadh air ath-riochdachadh agus biathadh aphid, agus mu dheireadh a’ leantainn gu am bàs25,26Tha an dàta seo a’ togail mòran cheistean. Mar eisimpleir, chan eil e soilleir fhathast ciamar a tha an heterodimer Nan-Iav air a chruthachadh, dè na làraichean ceangail a thathas a’ cleachdadh gus moileciuilean beaga atharrachadh, agus mar a bhios na moileciuilean beaga seo a’ riaghladh gnìomh seanail le bhith a’ cur bacadh air proprioception. A bharrachd air an sin, chan eil na h-adhbharan airson gu bheil Nan fhèin neo-ghnìomhach agus gu bheil dlùth-cheangal ìosal aige ri AP, agus an heterodimer Nan-Iav gnìomhach agus a’ ceangal AP le dlùth-cheangal nas àirde, soilleir fhathast. Mu dheireadh, chan eil mòran fiosrachaidh againn mu riaghladh gnìomh Nan-Iav a tha an urra ri Ca2+ agus mar a tha e air a thoirt a-steach do phròiseasan comharran neuronal.. 13,21
Anns an sgrùdadh seo, le bhith a’ cothlamadh mhicreasgopaidh crio-electron, electrophysiology, agus dòighean ceangail rèidioligand, shoilleirich sinn cruinneachadh Nan-Iav agus mar a cheanglas e ri riaghladairean moileciuil bheaga. A bharrachd air an sin, lorg sinn calmodulin (CaM) ceangailte gu bun-reachdail ri Iav agus pentamers Nan a tha air an seasmhachadh le AP. Tha na toraidhean seo a’ toirt sealladh cudromach air riaghladh ianan calcium ann an seanalan, cruinneachadh seanalan, agus na factaran a tha a’ dearbhadh dlùth-cheangal ligand. Nas cudromaiche, dhearbh sinn gu bheil pàirt chudromach aig ARD anns na pròiseasan sin. An sgrùdadh againn air seanalan meanbh-bhiastagan iomlan ceangailte ri puinnseanan àiteachais buntainneach.27, 28, 29a’ fosgladh chothroman airson leasachadh gnìomhachas puinnseanan-bhiastagan, a’ leasachadh èifeachdas agus sònraichteachd puinnseanan-bhiastagan, agus a’ comasachadh cleachdadh choimeasgaidhean a tha ag amas air TRPV ann an gnèithean eile gus dèiligeadh ri tèarainteachd bìdh cruinneil agus sgaoileadh ghalaran a tha air an giùlan le vectaran.
Fhuair sinn a-mach cuideachd gu bheil Nan-Iav air a riaghladh le Ca2+, agus gu bheil CaM ceangailte gu bun-reachdail a’ stiùireadh a’ mheacanaig riaghlaidh. Gu cudromach, tha an riaghladh seo de Nav le CaM, a tha an urra ri Ca2+, gu math eadar-dhealaichte bho mheacanaig riaghlaidh seanalan ian eile (me, seanalan Na+ le bholtaids agus seanalan TRPV5/6).52,53,54,55,56,57Anns an t-sianal Nav1.2, bidh raon C-criochnach CaM a’ ceangal gu h-eiligeach ris an raon C-criochnach (CTD), agus bidh Ca2+ ag adhbhrachadh ceangal an raoin N-criochnach aige ris a’ phàirt as fhaide den CTD.56Anns an t-sianal TRPV5/6, bidh fearann C-criochnach CaM a’ ceangal ri CTH, agus bidh Ca2+ ag adhbhrachadh leudachadh suas an fhearainn N-criochnach aige a-steach don phòr, agus mar sin a’ cur bacadh air treòiteachd cation.53,54Tha sinn a’ moladh modail airson gnìomh Nan-Iav-CaM a tha fo smachd Ca2+ (Figear 4h). Anns a’ mhodail seo, bidh raon N-criochnaichte CaM a’ ceangal gu bun-reachdail ri raon C-criochnaichte (CTH) Iav. Anns an staid fois (dùmhlachd ìosal [Ca2+]), bidh raon C-criochnaichte CaM ag eadar-obrachadh le Nan, a’ daingneachadh cumadh ARD agus mar sin a’ brosnachadh fosgladh seanail. Bidh ceangal agonist/meanbh-bhiastagan ris an t-sianal ag adhbhrachadh fosgladh nam pores, a’ leantainn gu sruth Ca2+. Bidh Ca2+ an uairsin a’ ceangal ri CaM, ag adhbhrachadh dealachadh raon C-criochnaichte bho ARD Nan. Leis gu bheil bacadh air ceangal CaM gu ìre mhòr a’ cuir às do bhuaidh bacaidh Ca2+, bidh an dealachadh seo ag atharrachadh gluasad ARD, agus mar sin ag adhbhrachadh casg no dì-mhothachadh a tha an urra ri Ca2+. Tha an ath-bheothachadh luath de shruthan seanail às deidh elution ian calcium (Figear 4g) a’ moladh gu bheil an dòigh-obrach seo a’ comasachadh freagairtean luath do chomharran neuronal a tha air am meadhanachadh le Ca2+. A bharrachd air sin, chaidh aithris gu bheil pàirt eile aig roinn C-criochnach Iav, nach eil air a thuigsinn gu math fhathast, ann an targaideadh seanalan agus riaghladh gnàthach.21
Mu dheireadh, tha an sgrùdadh againn a’ taisbeanadh structar àrd-rèiteachaidh de cho-thàthadh seanail TRP meanbh-bhiastagan-mharbhaiche-bhiastagan a tha cudromach ann an àiteachas – lorg nach robh aithnichte dhuinn roimhe. Gu sònraichte, chomharraich sinn structar agus gnìomh seanail nam biastagan ann an ceallan daonna (HEK293S GnTi–) seach ann an ceallan bhiastagan. An aghaidh barrachd is barrachd strì an aghaidh meanbh-bhiastagan agus cuideam leantainneach air tèarainteachd bìdh agus pathogens, tha an obair againn a’ toirt seachad fiosrachadh cudromach a chuidicheas le leasachadh meanbh-bhiastagan ùra airson buannachd slàinte dhaoine agus tèarainteachd bìdh cruinneil. Tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil meanbh-bhiastagan leithid AP èifeachdach an aghaidh cuid de phlàighean nuair a thèid an cleachdadh a rèir stiùiridhean an leubail agus gu bheil puinnseanta geur ìosal aca do phoileanairean buannachdail, a’ sealltainn an sàbhailteachd àrainneachdail.13,16A bharrachd air sin, tha deuchainnean air cuid de dh’fhuasglaidhean AP air mosgìotothan air sealltainn gu bheil iad mu dheireadh a’ call an comas itealaich. Le bhith a’ tuigsinn mar a cheanglas na todhar atharrachail seo ri Nan-Iav, bidh e nas fhasa todhar a th’ ann mar-thà atharrachadh no todhar ùra a leasachadh airson barrachd èifeachdais agusmionaideachsmachd plàighean. Tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gu bheil eadar-aghaidh Nan-Iav ARD deatamach chan ann a-mhàin airson gnìomhachd choimeasgaidhean dùthchasach, puinnseanan-bhiastagan, agus Ca2+-CaM a riaghladh, ach cuideachd airson cruinneachadh seanalan. Tha sinn a’ moladh gum faodadh briseadh cruinneachadh heterodimer le moileciuilean beaga a bhith na dhòigh-obrach gun samhail agus gealltanach airson luchd-bacadh seanalan ian a leasachadh.
De na h-ochd ginean orthologach, chaidh ginean làn-fhaid a’ bhìobaill dhonn (Halyomorpha halys) Nanchung agus Inactive a thaghadh, a’ nochdadh seasmhachd sàr-mhath ann an innealan-glanaidh. Chaidh na ginean co-churichte a bharrrachadh airson codon airson abairt dhaoine agus an clònadh a-steach don vectar pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) a’ cleachdadh làraichean cuingealachaidh XhoI agus EcoRI. Rinn seo cinnteach gu robh na clònaichean ann am frèam leis na tagaichean C-terminal GFP-FLAG-10xHis agus mCherry-FLAG-10xHis, a tha air an sgoltadh le protease HRC-3C (PPX), a’ leigeil le gnìomhachd neo-eisimeileach.abairtB’ iad na prìmearan a chaidh a chleachdadh gus Nanchung agus Inactive a chlònadh a-steach don vectar pBacMam mar a leanas:
Chaidh ìomhaighean miocroscopach de ghràineanan fa leth fhaighinn air miocroscop tar-chuir dealanach (FEI) Titan Krios G2 uidheamaichte le camara K3 agus criathrag lùtha Gatan BioQuantum. Chaidh am miocroscop obrachadh aig 300 keV, le suidheachadh lùtha de 20 eV, meud piogsail sampall de 1.08 Å/piogsail (meudachadh ainmichte de 81,000x), agus caisead dì-fhòcas eadar -0.8 agus -2.2 μm. Chaidh clàradh bhidio a dhèanamh aig 40 frèamaichean san diog a’ cleachdadh miocroscop Latitude S (Gatan) le ìre dòs ainmichte de 25 e–px−1 s−1, ùine nochdaidh de 2.4 s, agus dòs iomlan de mu 60 e–Å−2.
Chaidh ceartachadh gluasad air adhbhrachadh le beam agus cuideam dòs a dhèanamh air film a’ cleachdadh MotionCor2 ann an RELION 4.061. Chaidh measadh paramadair gnìomh gluasaid eadar-dhealachaidh (CTF) a dhèanamh ann an cryoSPARC a’ cleachdadh an dòigh measadh CTF stèidhichte air paiste62. Chaidh foto-mhicrografan le rùn freagarrachd CTF ≥4 Å a thoirmeasg bhon mhion-sgrùdadh às dèidh sin. Mar as trice, chaidh fo-sheata de 500–1000 foto-mhicrograf a chleachdadh airson taghadh puing ann an cryoSPARC, agus an uairsin grunn chuairtean de sheòrsachadh 2D às dèidh sìoladh gus ìomhaigh iomraidh shoilleir fhaighinn airson taghadh gràinean stèidhichte air teamplaid. Chaidh gràinean an uairsin a thoirt a-mach a’ cleachdadh bogsaichean crìche 64-piogsail agus binning 4-fhillte. Chaidh grunn chuairtean de sheòrsachadh 2D a dhèanamh gus roinnean gràinean nach robh iad ag iarraidh a thoirt air falbh. Chaidh a’ chiad mhodail 3D ath-thogail a’ cleachdadh ath-thogail ab initio agus a ghrinneachadh a’ cleachdadh grinneachadh neo-èideadh ann an cryoSPARC. Chaidh seòrsachadh 3D a dhèanamh ann an cryoSPARC no RELION stèidhichte air neo-aonachd ARD. Cha deach neo-aonachd chudromach sam bith fhaicinn ann an raointean membran. Chaidh gràinean a ghrinneachadh a’ cleachdadh nan dòighean C1 agus C2; Chaidh gràineanan le rùn C2 nas àirde a mheas mar cho-chothromach a thaobh C2 agus chaidh an toirt a-steach do RELION airson grinneachadh Bayesian. Chaidh na gràineanan an uairsin a ghluasad air ais gu cryoSPARC airson grinneachadh neo-aonfhoirmeil agus ionadail mu dheireadh. Tha an rùn mu dheireadh agus cunntadh nan gràineanan air an sealltainn ann an Clàr 1.
Nuair a bha sinn a’ giullachd pentamers Nan+AP, rannsaich sinn diofar dhòighean airson rùn raointean membran a leasachadh (gu h-àraidh an roinn pore), leithid toirt air falbh comharran agus masgadh TMD. Ach, cha robh na h-oidhirpean sin soirbheachail air sgàth an eas-òrdugh a dh’ fhaodadh a bhith anabarrach anns an roinn pore agus neo-chunbhalachd iomlan an TMD. Chaidh an rùn deireannach obrachadh a-mach le bhith a’ cleachdadh masg a chaidh a chruthachadh gu fèin-ghluasadach leis an dòigh giullachd neo-aonfhoirmeil ann an cryoSPARC, ag amas sa mhòr-chuid air roinn ARD. Choilean seo rùn gu math nas àirde na rùn raointean membran (gu h-àraidh roinn VSLD).
Chaidh modalan de novo tùsail de chruthan apo nam biastagan Nanchung agus Neo-ghnìomhach a chruthachadh an toiseach a’ cleachdadh Coot63, agus chaidh modalan de na biastagan Nan agus Iav a chruthachadh a’ cleachdadh AlphaFold264 gus roinnean le misneachd ìosal a chomharrachadh. Bha modaladh calmodulin stèidhichte air freagarrachd bodhaig chruaidh nam modalan ceangailteach Ca2+ agus saor bho Ca2+ ann an inntrigidhean PDB 4JPZ56 agus 1CFD65, fa leth. Chaidh na modalan a ghrinneachadh a’ cleachdadh grinneachadh spherical gus dèanamh cinnteach à stereochemistry ceart agus geoimeatraidh mhath. An uairsin chaidh Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, agus phosphatidylserine a mhodaladh mar dùmhlachdan lipid a chaidh a mhìneachadh gu math, agus chaidh na ligands NAM agus AP a chuir anns na dùmhlachdan co-fhreagarrach anns na ceanglaichean teann. Chaidh faidhlichean cuibhreachaidh a chruthachadh bhon t-sreang SMILES de na h-isoforms a’ cleachdadh eLBOW ann am PHENIX66. Mu dheireadh, chaidh na modalan a ghrinneachadh ann an àite fìor ann am PHENIX a’ cleachdadh sgrùdadh clèithe ionadail agus lughdachadh cruinneil le cuingealachaidhean structar àrd-sgoile. Chaidh am frithealaiche MolProbity a chleachdadh airson leasachadh modail agus mion-sgrùdadh structarail, agus chaidh dealbhan a dhèanamh a’ cleachdadh PyMOL agus UCSF Chimera X. 67,68,69 Chaidh mion-sgrùdadh fosglaidh a dhèanamh a’ cleachdadh am frithealaiche HOLE,70 agus chaidh mapadh glèidhteachais sreath a dhèanamh a’ cleachdadh am frithealaiche Consurf.71
Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh Igor Pro 6.2, Excel Office 365, agus GraphPad Prism 7.0. Tha a h-uile dàta cainneachdail air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± mearachd àbhaisteach (SEM). Chaidh deuchainn-t nan Oileanach (dà-earballach, gun chàradh) a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar dà bhuidheann. Chaidh mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh (ANOVA) agus an uair sin deuchainn iar-chothromach Dunnett a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar iomadh buidheann. *P< 0.05, **P< 0.01, agus ***PChaidh < 0.001 a mheas cudromach gu staitistigeil a rèir an sgaoileadh dàta. Chaidh luachan Kd, Ki, agus na h-eadar-amaichean earbsa 95% neo-chothromach aca obrachadh a-mach a’ cleachdadh GraphPad Prism 10.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu dhòigh-obrach an sgrùdaidh, faic Geàrr-chunntas Aithisg Portfolio Nàdair a tha ceangailte san artaigil seo.
Chaidh a’ chiad mhodail a thogail le bhith a’ cleachdadh nam modalan calmodulin bho stòran-dàta PDB 4JPZ agus 1CFD. Chaidh na co-chomharran a thasgadh ann am Banca Dàta Pròtain (PDB) fo na h-àireamhan inntrigidh 9NVN (Nan-Iav-CaM gun ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM ceangailte ri nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM ceangailte ri nicotinamide agus EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM ceangailte ri aphenidolpyrrolline agus calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM ceangailte ri aphenidolpyrrolline agus EDTA), agus 9NVS (Nan pentamer ceangailte ri aphenidolpyrrolline). Tha na h-ìomhaighean microscopaidh crio-eileagtronaigeach co-fhreagarrach air an tasgadh ann an Stòr-dàta Microscopaidh Eileachtronaigeach (EMDB) fo na h-àireamhan inntrigidh a leanas: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM gun ligand), EMD-49845 (co-thàthadh Nan-Iav-CaM le nicotinamide), EMD-49846 (co-thàthadh Nan-Iav-CaM le nicotinamide agus EDTA), EMD-49847 (co-thàthadh Nan-Iav-CaM le aphidopyrrolline agus calcium), EMD-49848 (co-thàthadh Nan-Iav-CaM le aphidopyrrolline agus EDTA), agus EMD-49849 (co-thàthadh Nan pentamer le aphidopyrrolline). Tha an dàta amh airson an anailis gnìomh air a thaisbeanadh san phàipear seo.
Àm puist: 28 Faoilleach 2026